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脓毒症小鼠肺微血管内皮细胞细胞因子基因表达
脓毒症及其并发症MODS一直是外科ICU病房的首要死亡原因[1].目前对脓毒症的发病机制尚不完全清楚,但一般认为其发生与机体的免疫炎症反应密切相关,是过度的炎症反应与代偿性抗炎症反应失衡的结果.内皮细胞作为炎症反应的另一重要参与者,近年颇受重视[2].本研究制造小鼠脓毒症模型后直接分离肺微血管内皮细胞,在不同时相对肺微血管内皮细胞促炎细胞因子TNFα、IL-1β和IL-6的基因表达进行了动态的观察和比较,以期为MODS的防治提出可能的新途径.
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热休克蛋白A12B对脂多糖诱导肺微血管内皮细胞损伤的影响
目的 探讨小鼠肺微血管内皮细胞(mPMVECs)热休克蛋白A12B (HSPA12B)表达下调对脂多糖(LPS)诱导的细胞炎症反应、迁移及超微结构改变的影响.方法 体外传代培养的mPMVECs分为LPS组(添加1 μg/mL LPS)、LPS+ siRNA组[瞬时转染法将HSPA12B相应基因片段干扰小RNA (siRNA)寡核苷酸转入mPMVECs中,再加入1μg/mL LPS)]和LPS+ NC组[瞬时转染法将平行对照(NC) siRNA寡核苷酸转入mPMVECs中,再加入1μg/mL LPS].对LPS+ siRNA组和LPS+ NC组,分别采用Transwell试验和细胞划痕实验观察细胞迁移情况;应用透射电子显微镜(透射电镜)观察mPMVECs超微结构改变;应用Real-Time PCR检测各组细胞中肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白介素-6(IL-6)、IL-10和IL-1β mRNA的表达.结果 与LPS+NC组比较,LPS+ siRNA组mPMVECs的线粒体损伤加重,内质网水肿更明显;细胞内TNF-α、IL-6和IL-10mRNA的表达显著上调(P＜0.05),而IL-1β表达下调,但差异无统计学意义(P＞0.05);细胞迁移功能显著下降(P＜0.05).结论 下调HSPA12B表达后,mPMVECs经LPS刺激的炎症反应增强,细胞迁移功能下降.HSPA12B可能参与保护mPMVECs免受LPS侵袭的过程.
关键词： 热休克蛋白A12B 脂多糖 小鼠肺微血管内皮细胞 -
细胞间黏附分子-1在 ARDS 小鼠肺微血管内皮细胞内的表达变化
目的：细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1， ICAM-1）在介导中性粒细胞肺部浸润的过程中起到很大作用。在脂多糖（ Lipopolysaccharides ，LPS）诱导的急性呼吸窘迫综合征小鼠模型中，观察ICAM -1以及丝裂原激活蛋白激酶2（mitogen-activated protein kinase activated protein kinase 2， MK2）和人抗原R（human antigen R，HuR ）在小鼠肺微血管内皮细胞（ pulmonary microvascular endothelial cell ， PMVEC）内表达的变化。方法健康清洁型6～8周雄性C57BL／6小鼠，随机数字表法分为对照组和LPS组，每组5只。 LPS组腹腔注射LPS 5 mg／kg （溶于100μL的PBS中），对照组腹腔注射PBS （5 mg／kg），24 h处死全部小鼠。在LPS诱导的小鼠ARDS模型中，用Real-time PCR方法检测小鼠肺组织分离得到的PMVEC内人抗原R（ human antigen R ，HuR）、ICAM-1的mRNA表达量，用Western blot法检测总MK2、磷酸化MK2、HuR以及ICAM-1表达量的变化，利用流式细胞仪检测PMVEC表面ICAM-1的表达量及肺部浸润的中性粒细胞数量。结果 LPS组小鼠肺组织W／D较对照组高，差异有统计学意义[（6．16±0．40） vs （3．61±0．28），P＜0．05]。流式细胞术检测LPS组中性粒细胞浸润率较对照组高[（13．92±3．23）％vs （3．24±1．24）％，P＜0．05]。 LPS刺激后小鼠肺组织中ICAM-1的mRNA及蛋白表达较对照组明显增加（P＜0．05），PMVEC表面ICAM-1表达较对照组也明显增加（P＜0．05）。 MK2总量无明显变化，磷酸化MK2较对照组明显增加，HuR mRNA及蛋白总量无明显变化，但存在核质转移。结论特异性阻断或减少微血管内皮细胞中HuR的表达可使ICAM-1表达减少，从而减少中性粒细胞的浸润，减轻ARDS病理生理改变，可为临床治疗ARDS提供一个新靶点。
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LPS诱导小鼠肺微血管内皮细胞VEGF表达的探讨
目的:研究小鼠肺微血管内皮细胞分离培养方法并探讨脂多糖(LPS)诱导小鼠肺微血管内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达.方法:贴块法培养小鼠肺微血管内皮细胞,并进行系列鉴定.采用ELISA方法检测正常组、LPS(1μg/ml)作用2、8、16、24、36、48h组的VEGF变化水平.结果:获得的小鼠肺微血管内皮细胞具有鹅卵石形态,但LPS对小鼠肺微血管内皮细胞形态影响明显.对异植物血凝素结合试验,CD31及Ⅷ因子抗原免疫组化染色为阳性.LPS(1μ g/ml)分别作用小鼠肺微血管内皮细胞2h组可见VEGF表达升高,8h组达高,16、24、36、48h组的表达量低于8h组.结论:LPS作用后,小鼠肺微血管内皮细胞VEGF表达呈抛物线型下降.LPS损伤内皮细胞功能和形态.
关键词： 脂多糖 小鼠肺微血管内皮细胞 (VEGF血管内皮生长因子) -
晚期糖基化终产物受体在脂多糖介导小鼠肺微血管内皮细胞骨架变化中的作用
目的：建立一种可以得到高纯度肺微血管内皮细胞的分离方法，并分别观察野生型小鼠及晚期糖基化终产物受体（RAGE）敲除小鼠细胞在脂多糖（LPS）刺激下细胞骨架F-actin变化情况。方法取6~8周龄野生型C57小鼠及RAGE基因敲除小鼠的肺，经I型胶原酶消化后，尼龙细胞筛过滤，然后采用免疫磁珠法分离原代小鼠肺微血管内皮细胞（PMVEC），经形态学及免疫荧光法鉴定后，以LPS（1 mg/L）刺激不同时间后用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架F-actin的变化情况。结果镜下可见原代培养的PMVECs呈梭形或多角形，经细胞抗Ⅷ因子相关抗原（ⅧF-Ag）染色鉴定纯度高，LPS刺激后野生型小鼠PMVEC骨架重排，形成应力纤维，而RAGE敲除小鼠PMVEC骨架破坏不明显。结论采用免疫磁珠法可以获得高纯度的小鼠肺微血管内皮细胞，且RAGE参与了LPS介导的小鼠肺微血管内皮细胞骨架破坏。
关键词： 小鼠肺微血管内皮细胞 脂多糖 晚期糖基化终产物受体 细胞骨架 -
高迁移率族蛋白 B1对内皮细胞通透性的影响
目的：研究高迁移率族蛋白B1（ HMGB1）对内皮细胞通透性的影响，以及HMGB1受体（ RAGE）和p38 MAPK通路在此病理过程中的作用。方法 HMGB1（200 ng／mL）与人脐静脉内皮细胞株分别在体外共同培养0、3、6、12和24 h，以0 h为对照检测HMGB1诱导单层内皮细胞通透性Pd改变的时间效应；用电阻法分别在0、3、6、12和24 h测量正常空白对照组（单纯培养基）和HMGB1组（200 ng／mL）的单层内皮细胞电阻值TER，比较两组间在相同时间点电阻值的差别；p38 MAPK抑制剂SB203580（25μmol／L）预先作用1 h，继以HMGB1（200 ng／mL）作用12h，比较不同组间细胞通透性的变化；以HMGB1（200 ng／mL）分别作用0、10、20、30、60 min后观察细胞内p38蛋白表达及磷酸化p38表达的时间效应；转染siRNA下调RAGE表达，或以原代培养野生型和RAGE（－／－）小鼠肺微血管内皮细胞培并继以HMGB1刺激，比较各组细胞内磷酸化p38蛋白表达的变化。通透性检测采用FITC荧光标记右旋糖酐漏出法及跨内皮电阻（ TER）测定法，蛋白表达用免疫印迹法检测。结果 HMGB1以时间依赖的方式引起单层内皮细胞通透性Pd的升高，12 h与0 h相比，差异有统计学意义（ P＜0.05）；且可使跨细胞电阻TER降低，在12 h与空白对照组相应时间点相比，差异有统计学意义（ P＜0.05）；也可引发p38蛋白磷酸化水平的升高，与0 min相比，差异有统计学意义（ P＜0.05）；SB203580预处理再以HMGB1刺激后细胞通透性明显降低，与HMGB1单纯刺激组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；RAGE siRNA转染后以HMGB1刺激细胞p38磷酸化水平显著下调，与HMGB1组相比，差异有统计学意义（ P＜0.05）；HMGB1刺激野生型小鼠PMVECs可诱导p38磷酸化，而RAGE（－／－）小鼠PMVECs则无此效应（ P＜0.05）。结论 HMGB1通过结合RAGE来激活p38诱导血管内皮细胞通透性的增高。
