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新型融合蛋白pro-SIRPα的构建及体外活性研究
筛选获得肿瘤特异性释放封闭肽的高亲和力新型融合蛋白pro-SIRPα并对其体外活性进行了研究.首先利用噬菌体表面展示肽库筛选能与信号调节蛋白SIRPα cv1活性区结合的短肽,并以含有尿激酶(uPA)酶切位点的linker将其连接在SIRPα-cv1融合蛋白的氨基末端,构建完整的pro-SIRPα.通过竞争ELISA实验验证pro-SIRPα前端封闭肽具有封闭效应.由于氨基端封闭肽的存在,pro-SIRPα与CD47的结合能力显著下降.而肿瘤微环境中富含uPA,可水解pro-SIRPα氨基末端的linker,使得封闭肽解离并暴露出的完整SIRPα-cv1,恢复与CD47的结合能力.因此,pro-SIRPα可特异性作用于肿瘤细胞,减少了与正常血液系统细胞的非特异性结合,降低了毒性以及可能引起的抗原沉默(antigen sink effect)现象.我们的体外实验还证实,与单独应用抗EGFR-IgG1单抗相比,pro-SIRPα与抗EGFR-IgG1单抗联用可显著增强巨噬细胞对A431肿瘤细胞的吞噬作用.pro-SIRPα的研制可能为肿瘤靶向治疗提供新的策略.
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重组信号调节蛋白α(SIRPα)胞外段及其高亲和力突变体的表达、纯化与活性鉴定
制备野生型信号调节蛋白α(SIRPα)胞外段和高亲和力突变体,并进行纯化条件优化与结合活性鉴定.通过全基因合成获得SIRPα-wt和高亲和力突变体SIRPα-cv1的全基因;利用分子克隆技术将其连入表达载体,终通过大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株表达TrX-SIRPαwt和Trx-SIRPα-cv1两种融合蛋白.通过肠激酶酶切去除融合标签以及多次层析纯化后,利用质谱技术分析目的蛋白所在组分.经SDS PAGE电泳显示,终获得了纯度高于90％的SIRPα-wt和SIRPmcv1,与CD47结合活性结果表明两种蛋白都能与CD47 Fc融合蛋白结合.据此,本研究成功表达并纯化得到了具有配体结合活性的SIRPα-wt和其高亲和力突变体SIRPα-cv1两种重组蛋白.
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CD47-SIRPα在人类红细胞老化与吞噬过程中的作用
探讨CD47-SIRPα在人类红细胞衰老与吞噬过程中的作用.采用Western blot检测体外4℃和37℃保存红细胞(RBC)及老化过程中红细胞膜上CD47的表达量;用单核细胞单层分析试验(monocyte monolayer assay,MMA)观察人THP-1单核细胞系对不同年龄段红细胞和CD47抗体F(ab')2端封闭红细胞的吞噬情况及Western blot检测THP-1细胞上SIRPa磷酸化情况.结果发现,无论是在体内老化还是体外老化过程中,红细胞膜上CD47的表达均出现显著下降趋势,随着保存时间的延长,CD47的表达量大可下降82.64%(4℃保存情况下);THP-1细胞对不同年龄段红细胞的吞噬情况存在差异性,更易吞噬年老红细胞,吞噬率为35.32,对年轻红细胞的吞噬率为13.72%(n=7,P<0.02);对新鲜红细胞的吞噬率为2.22 %,对CD47抗体F(ab')2端封闭红细胞的吞噬率为31.51%(n=7,P<0.02);吞噬不同年龄段红细胞后,THP-1细胞上磷酸化SIRPα量不同,与吞噬年轻红细胞相比,吞噬年老红细胞后,磷酸化SIRPα的量下降了57.12%.表明人类红细胞的老化与吞噬过程和CD47-SIRPα相互作用存在密切关系.
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SIRPα及其配体 CD47在巨噬细胞吞噬过程中的作用
SIRPα是信号蛋白家族（SIRPs）中典型的抑制性受体，可与体内广泛存在的跨膜糖蛋白 CD47相互作用，形成SIRPα／CD47信号复合体。此复合体在抑制巨噬细胞吞噬红细胞、调节异种移植免疫排斥反应及肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。且随着研究逐渐深入，巨噬细胞中 SIRPα／CD47途径为抑制红细胞清除、异种移植器官存活及肿瘤治疗提供新的治疗视角。
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天然免疫检查点CD47-SIRPα在恶性肿瘤中的研究进展
针对CTLA-4/B7和PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂现已广泛应用于临床,其他检查点抑制剂也正在开发中.CD47是广泛表达于正常细胞表面的蛋白质,在肿瘤细胞中呈过表达状态,其受体为髓系抑制性免疫受体SIRPα.阻断CD47与SIRPα之间的相互作用可增强巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬作用进而消灭肿瘤细胞.此外,越来越多的证据表明阻断CD47-SIRPα轴还可以增强抗原呈递细胞的功能,从而刺激T细胞介导的抗癌免疫.随着该领域研究的发展,CD47-SIRPα轴的临床应用将会是未来肿瘤免疫治疗的热点之一.
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表达SIRPα-Fc的基因-溶瘤腺病毒对胆管癌治疗作用的实验研究
目的:研究表达SIRPα-Fc融合基因的基因-溶瘤腺病毒SG655-SF对胆管癌的治疗作用.方法:将信号调节蛋白α(signal regulatory proteinα,SIRPα)突变体CV1与人IgG1 Fc段融合(简称SF),构建SF编码序列(基因).将SF基因插入条件增殖型腺病毒载体SG655,构建基因-溶瘤腺病毒SG655-SF.重组病毒经鉴定正确后,经扩增、滴度测定,感染293细胞.Western blot检测外源基因的表达情况.间接免疫荧光检测293细胞表达的SF蛋白对胆管癌细胞的结合能力.噻唑蓝(MTT)法测定病毒对胆管癌细胞的杀伤作用.建立人类胆管细胞癌裸鼠移植瘤模型,用SG655-SF治疗,观察疗效.取肿瘤组织进行切片检查,验证其抗肿瘤作用.结果:成功构建SF表达框、基因-溶瘤腺病毒SG655-SF.SG655-SF感染293细胞后,能高效表达SF蛋白.293细胞表达的SF蛋白能有效结合CD47高量表达的胆管癌细胞株EH-CA1-T、EH-CA1-Y.SG655-SF能有效杀伤胆管癌细胞.SG655-SF可以有效抑制肿瘤在裸鼠体内生长.肿瘤组织切片检查提示有肿瘤坏死和病毒浸润.结论:基因-溶瘤腺病毒SG655-SF具有良好的抗胆管癌活性.
