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新型融合蛋白pro-SIRPα的构建及体外活性研究
筛选获得肿瘤特异性释放封闭肽的高亲和力新型融合蛋白pro-SIRPα并对其体外活性进行了研究.首先利用噬菌体表面展示肽库筛选能与信号调节蛋白SIRPα cv1活性区结合的短肽,并以含有尿激酶(uPA)酶切位点的linker将其连接在SIRPα-cv1融合蛋白的氨基末端,构建完整的pro-SIRPα.通过竞争ELISA实验验证pro-SIRPα前端封闭肽具有封闭效应.由于氨基端封闭肽的存在,pro-SIRPα与CD47的结合能力显著下降.而肿瘤微环境中富含uPA,可水解pro-SIRPα氨基末端的linker,使得封闭肽解离并暴露出的完整SIRPα-cv1,恢复与CD47的结合能力.因此,pro-SIRPα可特异性作用于肿瘤细胞,减少了与正常血液系统细胞的非特异性结合,降低了毒性以及可能引起的抗原沉默(antigen sink effect)现象.我们的体外实验还证实,与单独应用抗EGFR-IgG1单抗相比,pro-SIRPα与抗EGFR-IgG1单抗联用可显著增强巨噬细胞对A431肿瘤细胞的吞噬作用.pro-SIRPα的研制可能为肿瘤靶向治疗提供新的策略.
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重组信号调节蛋白α(SIRPα)胞外段及其高亲和力突变体的表达、纯化与活性鉴定
制备野生型信号调节蛋白α(SIRPα)胞外段和高亲和力突变体,并进行纯化条件优化与结合活性鉴定.通过全基因合成获得SIRPα-wt和高亲和力突变体SIRPα-cv1的全基因;利用分子克隆技术将其连入表达载体,终通过大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株表达TrX-SIRPαwt和Trx-SIRPα-cv1两种融合蛋白.通过肠激酶酶切去除融合标签以及多次层析纯化后,利用质谱技术分析目的蛋白所在组分.经SDS PAGE电泳显示,终获得了纯度高于90％的SIRPα-wt和SIRPmcv1,与CD47结合活性结果表明两种蛋白都能与CD47 Fc融合蛋白结合.据此,本研究成功表达并纯化得到了具有配体结合活性的SIRPα-wt和其高亲和力突变体SIRPα-cv1两种重组蛋白.
