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结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341编码基因iniB的克隆与表达
目的 克隆并表达编码结核分枝杆菌H37RV株Rv0341蛋白的iniB基因.方法 利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增iniB基因,克隆于pET-22b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的 蛋白的表达及反应原性.结果 克隆并表达了iniB基因,表达的蛋白相对分子质量约43 000,诱导2 h表达量较高,约为25%.目的 蛋白主要以包涵体形式存在于超声沉淀中,纯化后蛋白纯度可达98%以上.经Western blot检测,纯化蛋白与依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)肺结核患者血清呈现强阳性反应,而与非依R菌肺结核患者血清不反应.结论 已成功克隆并表达了编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因,表达的重组蛋白具有反应原性及特异性,为依R菌结核病临床血清学快速诊断方法的建立及试剂盒的研发奠定了基础.
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基因芯片技术检测利福平药物诱导H37Rv株基因突变的应用研究
目的 用利福平、异烟肼药物作用H37RV株,诱导基因突变,用基因芯片技术检测耐药茵株突变基因位点.方法 H37Rv菌株用不同浓度的利福平和异烟肼加入培养液中观察菌株的耐药生长情况,耐药菌株用PCR扩增产物杂交,基因芯片检测药物作用部位是否有突变,检测突变基因位点.结果 利福平药物诱导H37Rv耐药,用基因芯片技术检测利福平耐药菌株,rpoB基因531位发生突变,TCG转变为TTG,直接测序发现在相同位点发生突变.耐异烟肼耐药菌株katG基因315位发生突变,AGC转变为ACC.同时加入两种药物的耐药株用基因芯片检测分别在rpoB基因531位,katG基因315位发生突变.结论 结核分枝杆菌产生耐药的机理与药物作用基因位点突变有关.基因芯片检测技术耐药菌株基因突变,不仅可以准确地确定突变位点和突变类型,快速、高效、设备简单,并能同时检测分析成千上万个基因有关突变位点.
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用两种药物同时诱导H37Rv株基因突变的研究
目的:用利福平、异烟肼药物作用H37Rv株产生耐药,诱导基因突变,用基因芯片技术检测耐药菌株突变基因.方法:用不同浓度的利福平、异烟肼同时加入培养液中观察菌株的耐药生长情况,用基因芯片检测耐药菌株基因突变.结果:两种药物同时作用H37Rv株仍能在培养液中生长,产生耐药,用PCR扩增产物杂交基因芯片技术检测发现,分别在rpoB基因531位,katG基因315住发生突变.结论:H37Rv株能在含多种药物的培养基中生长产生耐药,耐药的机理与药物作用基因位点突变有关.
