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环氧化酶-2基因shRNA重组腺病毒的构建及鉴定
目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标签的环氧化酶-2(cyclooxyge-nase-2,COX-2)基因shRNA重组腺病毒,并观察其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响.方法 将前期构建的真核表达质粒pGenesil-1-COX-2-shRNA及阴性对照质粒pGenesil-1-HK的表达启动子U6及shRNA序列亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAdTrack-U6-HK-EGFP,酶切及测序鉴定正确后,经Pme Ⅰ线性化,转化感受态AdEasier,构建重组腺病毒质粒pAd-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAd-U6-HK-EGFP,经Pac Ⅰ线性化,转染AD293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP和Ad-U6-HK-EGFP,经3轮扩增后,测定滴度.RT-PCR和Western blot法检测感染细胞中COX-2基因mRNA的转录及蛋白的表达,MTS法观察重组腺病毒对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响.结果 重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAdTrack-U6-HK-EGFP及重组腺病毒质粒pAd-U6-COX-2-shRNA-EGFP和pAd-U6-HK-EGFP经酶切和测序鉴定均构建正确,并成功转染AD293细胞,经包装和3轮扩增后,重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP和Ad-U6-HK-EGFP的滴度分别为1.4×1012和2.0×1012pfu/ml.重组腺病毒感染的SMMC-7721细胞中COX-2基因mRNA、蛋白相对表达量及细胞增殖能力均明显低于空白对照组及阴性对照组(P均＜0.05).结论 成功构建了COX-2基因shRNA重组腺病毒Ad-U6-COX-2-shRNA-EGFP,且可显著抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖,为进一步研究COX-2作为肝癌基因治疗靶点及机制奠定了基础.
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CerbB-2基因、COX-2基因在鼻咽癌中的表达及相关性研究
目的 探讨表皮生长因子受体-2(CerbB-2)基因、环氧化酶-2(COX-2)基因在鼻咽癌组织中的表达情况及两者间的相关性.方法 采用免疫组化SP法检测CerbB-2、COX-2基因在90例鼻咽癌组织和22例鼻咽炎性组织中的表达情况.结果 鼻咽癌组织中CerbB-2、COX-2基因表达的阳性率分别为65.56%和67.78%,鼻咽炎性组织分别为31.82%和36.36%,差异有统计学意义(P＜0.05);在鼻咽癌组织中两者表达呈正相关(r= 0.526,P＜0.01).结论 CerbB-2、COX-2基因在鼻咽癌中以高表达方式存在,它们在鼻咽癌中的表达呈正相关,并且有可能通过共同高表达来促使鼻咽癌的发生、发展,而它们共同作用的机制有待进一步研究.
关键词： 鼻咽癌 表皮生长因子受体-2基因 环氧化酶-2基因 免疫组织化学 -
RNA干扰环氧化酶-2抑制人表皮样喉癌细胞系增殖和侵袭的研究
目的 构建沉默环氧化酶-2 (COX-2)基因重组慢病毒,观察其体外侵袭的抑制作用,从而探讨干扰COX-2抑制喉癌细胞增殖的作用机理,为喉癌的治疗提供新的思路.方法 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测COX-2基因在人表皮样喉癌细胞(Hep-2)中的表达情况.利用上海吉凯公司RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体系统,构建针对COX-2基因慢病毒RNAi表达载体.转染Hep-2细胞,干扰COX-2基因的表达,实时定量PCR检测干扰前后基因表达变化.利用生长曲线测定干扰载体转染前后细胞生长速度变化.流式细胞仪检测细胞的生长周期.Boyden侵袭小室法测定体外侵袭力.结果 成功构建了COX-2慢病毒RNAi表达载体,并建立了干扰COX-2基因的Hep-2细胞系.实时定量PCR检测COX-2基因在Hep-2细胞系中过表达被显著抑制.生长曲线测定,COX-2基因干扰后细胞增殖明显变慢.流式细胞仪检测细胞的生长周期可见干扰组诱导Hep-2细胞凋亡,转染G0～G1期细胞数量明显上升,S期细胞减少,表明siRNA干扰Hep-2细胞后,细胞由G0～G1期进入到S期受到阻滞,细胞增殖速度下降.体外侵袭实验中,Hep-2-AS侵袭细胞数(31.0±1.8)显著低于Hep-2细胞(104.0±2.6)及Hep-2-P细胞(99.0±2.7),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 喉癌中过表达的COX-2基因被干扰后表达明显降低并显著抑制细胞的生长速度和侵袭能力.同时验证了COX-2基因RNA干扰在进行抗肿瘤的治疗中潜在的应用前景.
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联合检测WT1基因和COX-2基因表达在急性白血病的临床价值
目的 通过观察急性白血病(AL)患者WT1基因(WT1 mRNA)和COX-2基因(COX 2 mRNA)的表达情况,探讨其相关关系及临床检测价值.方法 125例初诊AL患者为研究对象,采用实时荧光定量PCR(RQ PCR)动态检测WT1mRNA和COX-2 mRNA的表达水平,并分析其与临床参数的相关性.结果 初诊AL患者WT1 mRNA和COX-2 mRNA表达水平(中位数157.7和163.2)均显著高于正常对照组(中位数1.65和0.87) (P＜0.01),且WT1 mRNA与COX-2mRNA表达水平呈相关性(r=0.509,P＜0.05).初诊AL患者WT1 mRNA和COX-2 mRNA的表达水平显著高于缓解组(中位数3.65和4.37)(P＜0.05);缓解组AL患者WT1 mRNA和COX-2 mRNA的表达水平与对照组的差异无统计学意义(P＞0.05);复发组AL患者WT1 mRNA和COX-2 mRNA的表达水平(中位数167.9和178.5)与初诊组的表达水平差异无统计学意义(P＞0.05).WT1 mRNA表达水平在AL各亚型之间差异有统计学意义(X2=423.567,P＜0.01),M5WT1 mRNA表达水平低,M3表达高.结论 AL患者WT1基因与COX-2基因表达水平存在相关性,联合检测WT1 mRNA和COX-2 mRNA,可作为AL患者疗效评价、监测微小残留病和预后判断的指标,为临床化疗方案个体化提供更可靠的依据.
