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重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP及其突变体的构建与鉴定
目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HA标签的SH2基因重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP及其突变体Ad5-hSH2mt-EGFP,并观察其对K562细胞增殖的影响.方法 设计并化学合成引物,采用RT-PCR法扩增hSH2基因,重叠PCR法扩增hSH2mt基因,分别克隆至pAdTrack-CMV,构建穿梭质粒,经Pme I酶切,转化感受态pAdEasy-BJ5183,在细菌内同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒质粒pAd5-hSH2-EGPF和pAd5-hSH2mt-EGPF.Pac Ⅰ酶切后转染AD293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP,扩增病毒,测定滴度并经PCR和Western blot鉴定.重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测病毒对K562细胞增殖活性的影响.结果 重组腺病毒质粒pAd5-hSH2-EGFP和pAd5-hSH2mt-EGFP经酶切鉴定构建正确;重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP的滴度均可达1.6×1012;PCR结果表明,2种重组腺病毒包装和扩增成功,Western blot结果表明,重组腺病毒携带的目的 基因能够在AD293细胞中表达;MTT检测证实,Ad5-hSH2-EGFP 对K562细胞的增殖具有明显的抑制作用.结论 已成功构建重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP,Ad5-hSH2-EGFP能在体外明显抑制K562细胞的增殖,为进一步探讨SH2基因对慢性粒细胞白血病的治疗作用及其机制奠定了基础.
关键词： 重组腺病毒 含SH2域蛋白质酪氨酸磷酸酶类 K562细胞 细胞增殖 -
腺病毒介导的SD-HA融合蛋白表达对慢性粒细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响
目的 探讨腺病毒介导的SD-HA融合蛋白表达对慢性粒细胞白血病(CML)细胞增殖和凋亡的影响.方法 外源性融合蛋白表达的检测采用Western blot;细胞经免疫荧光染色后用激光共聚焦显微镜观察SD-HA融合蛋白在细胞中的定位;采用MTT法检测细胞增殖的情况;采用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡.结果 SD-HA、SmD-HA融合蛋白能在CML细胞株中有效表达,且定位于胞浆.重组腺病毒Ad5F35-SD-HA感染CML细胞后能特异性阻滞CML细胞周期由G0/G1期向S期推进,具有抑制细胞的增殖效应,且对照组比较早期凋亡细胞明显增多(P＜0.05).结论 腺病毒介导的SD-HA基因转染对CML细胞有抑制增殖和诱导凋亡的双重效应.
