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小鼠MIP-1α真核表达质粒的构建及在HSV-Ⅱ核酸疫苗中的应用
目的:构建小鼠巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)的真核表达质粒,观察其作为分子佐剂对单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)DNA疫苗免疫效果的影响.方法:以LPS刺激RAW264.7细胞提取总RNA.采用RT-PCR扩增出MIP-1α基因的全部编码序列,利用克隆载体pUCm-T,将其亚克隆入pcDNA3中,构建出小鼠MIP-1α的真核表达质粒Pm;将其转染COS-7细胞,并用Boyden趋化小室法检测MIP-1α的生物学活性.然后用其与HSV-ⅡgD的DNA疫苗一起免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠的特异性抗体、脾T细胞增殖反应及病毒攻击小鼠后对小鼠的保护率,观察MIP-1α对HSV-Ⅱ DNA疫苗免疫效果的影响.结果:成功构建了小鼠MIP-1α的重组真核表达质粒;免疫BALB/c小鼠发现,其作为分子佐剂可加强HSV-ⅡgDNA疫苗的免疫效果.结论:小鼠MIP-1α可作为HSV-Ⅱ gD DNA疫苗的分子佐剂,为研制新型有效的HSV-Ⅱ DNA疫苗提供一定的依据.
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分子佐剂C3d的研究进展
血清补体蛋白C3是宿主先天性免疫防御补体系统的中心分子,在补体活化的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集途径中均发挥枢纽作用.1996年,Dempsey等[1]制备了鸡卵溶菌酶(hen egg lysozyme,HEL)分别与1～3个小鼠C3d分子融合的偶联蛋白.以此重组抗原免疫小鼠,发现HEL-C3d2和HEL-C3d3比天然抗原的免疫原性分别提高了1 000和10 000倍,其佐剂作用远远大于完全弗氏佐剂.因此,近年来C3d作为一种新型的佐剂分子日益引起人们的关注.
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小鼠精子Sp17与IL-5融合蛋白的免疫性避孕效应和安全性研究
目的:研究小鼠精子抗原sp17与佐剂IL-5融合蛋白避孕疫苗的避孕效应及毒性作用.方法:重组蛋白疫苗Sp17-IL-5经鼻内免疫途径免疫小鼠后,观察其妊娠率、每胎产仔数,对免疫后小鼠的重要脏器进行病理学检查,并对免疫后小鼠及其子代的骨髓有核红细胞的微核及精子进行检测.结果:蛋白疫苗Sp17-IL-5鼻内免疫雌性Balb/c小鼠可明显降低受孕率和每胎产仔数,免疫后小鼠的重要脏器病理学检查未见明显异常改变,免疫后小鼠及其子代的骨髓有核红细胞微核率及精子畸形率均无明显变化.结论:重组蛋白疫苗sp17-IL-5有较明确的抗生育作用,对免疫后小鼠及其子代未产生明显的毒副作用.
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hCGβ-(CTP)4和hCGβ-(CTP)4-(C3d-P28)4在大肠杆菌中的表达及纯化
目的:在大肠杆菌BL21(DE3)中表达hCGβ-(CTP)4、hCGβ-(CTP)4-(C3d-P28)4融合蛋白,并对蛋白进行分离纯化.方法:将Pbsmr-(CTP)4中的(CTP)4基因片断克隆入表达载体Pet-28a(+),得到表达质粒Pet-28a(+)-(CTP)4.将PCR获得的补体C3d-P28 DNA序列以头尾串连的方式构建四聚体.将(C3d-P28)4基因片断克隆入Pbsmr-(CTP)4,得到Pbsmr-(CTP)4-(C3d-P28)4,进一步得到表达质粒Pet-28a(+)-(CTP)4-(C3d-P28)4.将表达质粒Pet-28a(+)-(CTP)4和pET-28a(+)-(CTP)4-(C3d-P28)4分别转化入大肠杆菌BL21(DE3),表达融合蛋白hCCβ-(CTP)4和hCGβ-(CTP)4-(C3d-P28)4.采用Ni-NTA-resin和凝胶过滤方法纯化蛋白.结果:菌株经IPTG诱导后检测到目的基因的表达产物,SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白的分子量分别为27 kD和40 kD左右.结论:在BL21(DE3)中成功表达了hCGβ-(CTP)4和hCGβ-(CTP)4-(C3d-P28)4融合蛋白,并确立了纯化方法,为进一步研究其免疫原性和应用于抗肿瘤疫苗奠定了基础.
关键词： hCGβ-CTP多聚体 C3d 分子佐剂 表达 纯化
