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神经营养素4前导序列介导Exendin-4表达质粒的构建及鉴定
目的：构建神经营养素4前导序列介导的可分泌表达Exendin-4的重组腺伴病毒载体，为探究Exendin-4用于2型糖尿病临床治疗提供实验基础。方法：使用互补引物/模板法及T载体克隆法扩增Exendin-4的cDNA克隆，连接于NT4前导肽序列的3′端，融合基因NT4- Exendin-4亚克隆于穿梭质粒pSSHG，转染HEK-293细胞，包装病毒，斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果：经酶切、测序证实克隆出Exendin-4 cDNA，成功构建同一开放读码框ORF的NT4前导肽Exendin-4 cDNA克隆，得到高滴度（2.5×109 pfu·L-1）的重组腺相关病毒。结论：通过分子克隆技术成功制备了Exendin-4的重组腺伴病毒载体pSSHG /NT4-Exendin-4并成功包装了较高浓度的重组病毒，为进一步研究Exendin-4功能及应用于临床打下基础。
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神经营养因子4及其受体TrkB在肺纤维化大鼠中的表达
探讨神经营养因子4(NT4)及其受体酷氨酸激酶受体B(TrkB)与大鼠肺纤维化发生发展的关系,为肺纤维化发病机制的研究开辟新的途径.方法:取Wistar健康雄性大鼠30只作为研究对象,分为对照组(气管内注射生理盐水)、模型组(气管内灌注博来霉素).两组大鼠分别于造模后第7、14、28天各处死5只,取出肺组织,用HE染色及Masson染色来比较造模的程度,用PCR和免疫组化检测模型组及对照组中NT4及TrkB的含量.结果:模型组造模后第7、14、28天NT4及TrkB均有不同程度的增高,且均随肺纤维化程度的增高而增高(P＜0.05),二者呈正相关(P＜0.001);对照组在对应时间段二者无明显变化(P＞0.05).结论:NT4及其受体TrkB在肺纤维化大鼠中表达增加,可能与肺上皮细胞增生及TrkB/NT4轴的信号传导被扰乱等因素有关,说明NT4及其受体参与肺纤维化的发生发展过程.
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NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因重组腺相关病毒载体的构建及鉴定
目的:设计构建融合基因NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的重组腺相关病毒表达载体.方法:应用非对称引物/模板法,PCR技术制备Ant-Shepherdin[79-87]cDNA片段,通过连接pGEM-T-Easy载体及PBV220-NT4质粒,转化感受态细胞,获得NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因,连接腺相关病毒穿梭质粒pSSHG-CMV,采用磷酸钙沉淀法三质粒共转染HEK-293细胞获取重组腺相关病毒,Dot-blot法测定重组病毒滴度,MTT比色法观察重组腺相关病毒对A549细胞存活率的影响.结果:合成Ant-Shepherdin[79-87]基因,连接PBV220-NT4,经克隆、酶切,琼脂糖凝胶电泳证实获得321 bp的NT4-Ant-Shepherdin[79-87]目的基因;得到高滴度的(3.4×1013pfu/L)重组腺相关病毒表达载体;带有融合基因NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的重组腺相关病毒对A549细胞具有强烈的诱导凋亡作用.结论:成功构建了NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因的重组腺相关病毒表达载体,为进一步研究针对Survivin的靶向抗肿瘤作用奠定了基础.
