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大肠杆菌偏嗜性密码子组成的人降钙素(hCT)编码序列的克隆
目的:克隆适于在大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)中表达的人降钙素(hCT)基因,为提高其表达水平奠定基础.方法:根据大肠杆菌密码子频率表,在不改变hCT氨基酸组成的前提下,设计并合成适于在大肠杆菌中表达的编码hCT的DNA序列,经PCR扩增后,与质粒载体pGEM -Teasy进行连接.连接产物转化感受态JM109大肠杆菌,筛选阳性菌落,经扩大培养后,对所含重组质粒进行鉴定.结果:经酶切鉴定及DNA序列分析证实,hCT编码DNA序列成功地克隆入pGEM -Teasy载体中,其序列与设计的完全一致.结论:完成了大肠杆菌偏嗜性人降钙素基因的克隆,为下一步hCT表达载体的构建及在大肠杆菌中进行表达的研究奠定了基础.
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重组成肌细胞合成人降钙素促进大鼠成骨细菌细胞增殖和分化
背景:大剂量多次喷鼻或者肌注降钙素能有效地预防绝经后妇女脊柱骨的丟失.但是降钙素需要长时期反复用药、价格昂贵、且有弱的抗原性,限制了长期使用.基因治疗可以为骨质疏松症提供更加有效、经济的治疗方案,同时减少药物的副作用.目的:观察人降钙素基因在成肌细胞中的表达,分析重组人降钙素对体外大鼠成骨细胞的影响.设计:以基因为实验对象,对比观察实验.单位:复旦大学放射医学研究所.材料:实验于2005-12/2006-06在复旦大学放射医学研究所完成.选用健康SD胎鼠10只,由复旦大学放射医学研究所提供.人降钙素单克隆抗体购于美国santa Cruz生物技术公司.L6成肌细胞由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所提供.方法:在L6成肌细胞培养基中分别加入pcDNA3.0-hCT脂质体转染混合物(转染组)和空载体pcDNA3.0脂质体混合物(对照组)进行培养.采用ELISA法、Westem Blot和免疫组织化学鉴定目的基因的蛋白表达.在成骨细胞培养基中分别加入1×10-14,1×10-13,1×10-12mol/L重组人降钙素和MEM.主要观察指标:利用MTT和检测碱性磷酸酶活性的方法观察大鼠成骨细胞增殖和分化的变化.结果:EUSA法可在细胞培养液中检测到降钙素蛋白;Western blot及免疫组化均证实人降钙素在转染后的成肌细胞中获得稳定表达.当重组人降钙素的浓度为1×10-14,1×10-13 mol/L时成骨细胞活性和成骨细胞碱性磷酸酶活性较对照组增高,但差异无显著性意义(P＞0.05);浓度升高为1×10-12 mol/L时,明显高于对照组(P＜0.05).结论:借助基因转染的方法,成肌细胞可以稳定合成、分泌人降钙素.重组人降钙素有促进骨形成的作用.
