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改善微囊化人视网膜色素上皮细胞生长状态的研究
目的 观察上皮细胞培养液中添加果糖、成纤维细胞生长因子和牛磺酸后对人视网膜色素上皮(hRPE)细胞海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化后的细胞总数、存活率及活细胞数的影响.方法 将hRPE细胞微囊化后将其分为4组,一组作为空白对照组(空白组)只加入上皮细胞培养液、另外3组在培养液中分别加入果糖(果糖组)、成纤维细胞生长因子(成纤维细胞生长因子组)、牛磺酸(牛磺酸组)后培养7 d,在0、1、3、7 d测定微囊内细胞的细胞总数、存活率及活细胞数.结果 4组细胞微囊化后的hRPE细胞至培养7 d,细胞存活率低为(75.00±3.00)%,但各组间差异无统计学意义(P均＞0.05);而微囊内细胞总数牛磺酸组(7.20±0.36)×104、成纤维细胞生长因子组(8.00±0.46)×104,比空白对照组(6.10±0.56)×104明显增多(t值分别为-2.872、-4.564,P均＜0.05),果糖组(6.00±0.46)×104与空白组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 细胞生长因子、牛磺酸可促进海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊内的hRPE细胞的增殖.
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nmhaFGF和haFGF 对放线菌素D诱导的人视网膜色素上皮细胞凋亡的保护作用
目的 探讨非促分裂型人酸性成纤维细胞生长因子(non-mitogenic human acidic fibmblast growth factor,nmhaFGF)和 haFGF对放线菌素D诱导的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞凋亡的保护作用,同时探讨2种浓度放线菌素D诱导hRPE细胞凋亡模型的复制条件.方法 用0.25 mg·L-1和0.50 mg·L-1放线菌素D诱导hRPE细胞凋亡,用琼脂糖凝胶电泳检测2种浓度放线茵素D诱导hRPE细胞DNA断裂情况,并用流式细胞仪检测放线菌素D诱导hRPE细胞的凋亡率,确定诱导hRPE细胞凋亡的条件,分另q以0.02 mg·L-1、0.06 mg·L-1、0.18 mg·L-1、0.54 mg·L-1和1.62 mg·L-1的nmhaFGF和haFGF预作用于hRPE细胞24 h,并设置正常细胞组和凋亡模型细胞组,观察nmhaFGF和haFGF对hRPE细胞凋亡的作用.结果 0.25 nag·L-1和0.50 mg·L-1放线菌素D诱导hRPE细胞凋亡16 h后细胞凋亡率分别为32.68%和53.27%.琼脂糖凝胶电泳结果显示0.25 mg·L-1放线菌素D诱导细胞凋亡条带清晰,而0.50 mg·L-1放线茵素D诱导hRPE细胞凋亡条带模糊,因此0.25 mg·L-1放线菌素D作用hRPE细胞16 h是诱导hRPE细胞凋亡的佳条件.在nmhaFGF各剂量组中,随着nmhaFGF浓度升高,hRPE细胞凋亡率明显降低,其中1.62 mg·L-1剂量组细胞凋亡率低,为(11.49±0.50)%;相同浓度haFGF各剂量组细胞凋亡率也呈现不同程度的降低,但随着haFGF剂量升高,凋亡率下降的趋势不如nmhaFcF剂量组明显,在haFGF剂量组中,1.62 mg·L-1剂量组细胞凋亡率低,为(14.35±1.02)%,nmhaFGF和haFGF对hRPE细胞凋亡率的下降作用经比较差异无统计学意义.结论 haFGF和nmhaFGF都可以发挥对hRPE细胞凋亡的保护作用.该保护作用可能是通过发挥其非促分裂活性实现的.
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缺氧及小干扰RNA转染对人RPE细胞增生及血小板源性生长因子-BB表达的影响
背景 增生性玻璃体视网膜病变(PVR)为视网膜表面发生无血管、纤维细胞性增生膜,其发生和发展的具体机制尚未完全阐明.人视网膜色素上皮(hRPE)及血小板源性生长因子(PDGF)在PVR发展中的作用是近几年研究的热点. 目的 探讨缺氧对体外培养hRPE细胞PDGF-BB表达及增生的影响. 方法 hRPE细胞在6孔板中培养,实验组用10、15、20、30、40 μmol/L CoCl2模拟体外培养hRPE细胞的缺氧环境,对照组用未加CoCl2的培养液培养hRPE细胞,采用逆转录PCR(RT-PCR)与ELISA法检测PDGF-BB mRNA和蛋白的表达,采用MTT法检测hRPE细胞增生率.依据转染siRNA的不同将细胞分为PDGF-BB siRNA1组、PDGF-BB siRNA2组、PDGF-BB siRNA3组(为针对PDGF-BB的3条不同的siRNA,其中有一条为有效siRNA)、β-actin siRNA组、无关siRNA组和只加Lip2000的空白对照组.转染4～6h后,除空白对照组外,其余各组加入对细胞PDGF-BB mRNA和蛋白及对hRPE细胞增生影响明显的15 μmol/L CoCl2模拟细胞缺氧环境24 h,检测PDGF-BB mRNA和蛋白及hRPE细胞增生率. 结果 未加CoCl2的对照组未检测出PDGF-BBmRNA和蛋白的表达,不同浓度CoCl2培养hRPE细胞PDGF-BB mRNA和蛋白的表达量不同,差异均有统计学意义(F=43.737,P＜0.01;F=54.612,P＜0.05),15μmol/L CoCl2组PDGF-BB的表达量多,与其他各组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).MTT检测结果显示,不同浓度CoCl2处理后PDGF-BB蛋白表达及hRPE细胞增生率明显不同,差异均有统计学意义(F=95.379,P＜0.01;F=63.375,P＜0.05),15 μmol/L CoCl2组hRPE细胞增生率明显高于其他浓度组,差异均有统计学意义(P＜0.05),PDGF-BB蛋白表达量与hRPE细胞增生率呈线性正相关(r=0.994,P＜0.05).各细胞转染组hRPE细胞中PDGF-BB mRNA及蛋白的表达整体比较,差异均有统计学意义(F=156.330、125.650,P＜0.01),且PDGF-BB siRNA2组PDGF-BB mRNA较其他各组明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.01).MTT检测结果显示,各细胞转染组PDGF-BB蛋白的表达及hRPE细胞增生率明显不同,差异均有统计学意义(F=73.131、98.564,P＜0.01),PDGF-BB siRNA2组PDGF-BB蛋白的表达及细胞增生率与其他各组比较明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05),PDGF-BB蛋白表达与hRPE细胞增生率呈线性正相关(r=0.996,P＜0.05).结论 缺氧能够促进PDGF-BB的表达,PDGF-BB的表达上调可显著促进hRPE细胞的增生.在转染靶向PDGF-BB siRNA后,PDGF-BB的表达受到抑制,可有效降低hRPE细胞的增生率.
关键词： 血小板源性生长因子-BB蛋白 人视网膜色素上皮 二氯化钴 增生 siRNA
