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人Izumo4和Tssk6 cDNA的重组及其多克隆抗体的制备
目的：研究Izumo4和Tssk6在精卵融合中的相互作用。方法根据世界卫生组织标准选取的正常精液标本取自内蒙古医科大学附属医院生殖医学中心。 SPF级昆明种小鼠5只，雄性，4～6周龄，体质量18～22 g。利用精液提取RNA，克隆人类Izumo4和Tssk6的cDNA序列，原核表达，通过重组质粒pMD-Izumo4、重组质粒pMD-Tssk6转染BL21（DE3）感受态菌制备 HIS-Izumo4和 HIS-Tssk6；然后通过小鼠腹腔制备小鼠抗人 Izumo4和 Tssk6腹水多克隆抗体。结果提取的人精子RNA在260 nm光密度值与280 nm光密度值比值为1．86、1．87，提取物无蛋白和杂质。克隆出正确的Izumo4和Tssk6 cDNA序列的pMD-Izumo4和pMD-Tssk6重组质粒。 pET-Izumo4和 pET-Tssk6重组载体在E.coli BL21（DE3）中复制，表达HIS-Izumo4和HIS-Tssk6融合蛋白，其相对分子质量分别位于35000～45000、45000～55000。2次切胶后，获得较纯的HIS-Izumo4/Tssk6融合蛋白。通过小鼠腹腔免疫，获得可以识别人内源性Izumo4和Tssk6蛋白的小鼠抗人HIS-Izumo4/Tssk6腹水多克隆抗体。结论实验制备小鼠抗人HIS-Izumo4/Tssk6腹水多克隆抗体，可特异性识别人的Izumo4/Tssk6蛋白，可以用于对人HIS-Izumo4/Tssk6蛋白的研究。
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c.822+126T》G/C:TSSK6基因的三等位基因多态可能与人类生精障碍相关
TSSK6是睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸家族成员.Tssk6基因敲除小鼠由于精子生成障碍导致不育,表现为:精子数量下,降,有活力的精子数减少,精子活力下降,形态异常精子数增加.我们推测TSSK6基因的变异可能与人类生精障碍有.关.用变性高效液相层析和DNA测序技术,对519例无精症和严重寡精症患者和359例正常生精对照者进行TSSK6突变筛查.比较患者组和对照组中多态位点的等位基因和基因型的频率差异.我们发现一个新的三等位基因多态,命名为c.822+126T>G/C.基因型TT和等位基因T在不育患者中的频率高于对照组;而基因型GC等位基因G和C的频率在对照组中的频率高于患者组.进一步研究表明,等位基因C在少精症患者中的频率显著高于对照组.我们的结果首次提示TSSK6i基因的c.822+126T>G/C可能与人类生精障碍相关,其中等位基因T可能是男性不育的一个风险因素,而等位基因G和C可能降低男性不育的易感性.
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人类Izumo4和Tssk6在精子顶体反应前后的定位检测
目的 鉴定人Izumo4和Tssk6在精子顶体反应前后的位置.方法 在实验室自制小鼠抗人Izumo4和Tssk6多克隆抗体,采用免疫组织化学法分别检测顶体反应前后Izumo4和Tssk6在人精子中所处的位置.结果 顶体反应前,经抗HIS-Izumo4多克隆抗体处理的精子在头部赤道靠上部位染色稍浅,而赤道上膜染色稍深,经抗HIS-Tssk6多克隆抗体处理的精子在尾部和赤道靠上部位染色较深.顶体反应后,经抗HIS-Izumo4和抗HIS-Tssk6腹水处理过的精子顶体膜均明显破裂且对3-氨基-9-乙基咔唑染色剂不显色.结论 Tssk6位于精子头部的顶体内部及精子尾部,Izumo4位于顶体外膜上.
