首页 > 文献资料
-
重组胶质细胞生长因子2蛋白的原核表达及纯化
目的 通过原核表达的方法得到胶质细胞生长因子2(GGF2)重组蛋白.方法 将不含信号肽编码序列的GGF2基因用亚克隆的方法自PVT-GGF2质粒克隆至PCXJI8质粒,再由PCXJ18-GGF2质粒克隆至pET-32b(+)质粒,构建pET32b(+)-GGF2表达载体.表达载体转染4种宿主菌,筛选合适者.优化表达时程和IPTG诱导剂量.GGF2大量表达后回收包涵体,复性.复性产物利用His Bind树脂进一步纯化.纯化产物用Western blot鉴定.结果 测序鉴定表明,成功构建pET-32b(+)-GGF2表达载体.筛选结果表明Origami B(DE3)为合适宿主菌.适宜的表达条件为30℃诱导前扩增,浓度25 μmol/L IPTG,37℃诱导2h.所表达外源蛋白相对分子质和预期一致.回收、纯化后得到纯度约为96％的产物.Western blot鉴定表明所获为GGF2重组蛋白.结论 原核表达方法得到足量GGF2重组蛋白.
-
脂质体介导增强型绿色荧光蛋白和胶质细胞生长因子双基因载体在脊髓内共转染表达
目的:构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)和胶质细胞生长因子2(glial growth factor 2, GGF2)的双基因真核表达载体pIRES2-EGFP-GGF2, 研究GGF2在大鼠脊髓内的表达.方法:采用RT-PCR方法从大鼠胎脑组织总RNA中扩增出GGF2全序列cDNA,利用脑炎心肌炎病毒的内部核糖进入位点(internal ribosome entry site, IRES),构建GGF2与EGFP双基因真核表达载体pIRES2-EGFP-GGF2.采用基因注射法将阳离子脂质体Transfectam和pIRES2-EGFP-GGF2基因混合后转染至大鼠胸段脊髓组织中,观察GGF2在大鼠脊髓中的表达.结果:成功构建pIRES2-EGFP-GGF2质粒,在转染的局部脊髓内观察到GGF2 mRNA表达显著增加.荧光显微镜下观察发现,注射局部灰质和白质神经元内均有较多绿色荧光蛋白表达.结论:阳离子脂质体能介导EGFP和GGF2双基因载体在脊髓内同时表达,EGFP可作为报告基因观察GGF2在脊髓内的表达.
