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牛肾小球基底膜Ⅳ型胶原α链非胶原区1的分离纯化及其在抗肾小球基底膜相关疾病中的应用
目的:分离纯化抗肾小球基底膜(GBM)抗体的特异性靶抗原,并评价其在抗GBM抗体检测中的应用价值.方法:通过孔径不同的筛网从牛肾脏中提取牛肾小球,采用改良的40 g*L-1去氧胆酸钠破坏肾小球细胞而获得GBM,经胶原酶消化后收集可溶性牛GBM粗抗原.在pH 7.5的条件下经Mono Q阴离子交换层析柱分离纯化肾小球基底膜Ⅳ型胶原α链非胶原区1[α(Ⅳ)NC1],并经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot鉴定其纯度及活性.应用2 mg*L-1纯化的牛α(Ⅳ)NC1包被酶标板,建立牛α(Ⅳ)NC1-ELISA 方法检测血清中抗GBM抗体,并与经典的以人GBM可溶性蛋白为粗抗原的ELISA法进行对照研究.血清来自90例已知抗人GBM抗体阳性的患者、100例正常人和50例其他肾脏疾病患者.对两种方法进行相关分析并计算牛α(Ⅳ)NC1-ELISA的敏感性、特异性.结果:纯化的牛α(Ⅳ)NC1经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表现为相对分子质量为25×103和50×103的蛋白并可被抗GBM抗体阳性血清所识别;应用牛α(Ⅳ)NC1-ELISA法检测抗GBM抗体的敏感性和特异性分别为100%和98%,与人GBM粗抗原-ELISA的相关性为0.6.结论:应用改良的去氧胆酸钠方法破坏肾小球内细胞并进一步经MonoQ离子交换柱分离纯化牛α(Ⅳ)NC1,可以得到高纯度的特异性靶抗原;纯化的牛α(Ⅳ)NC1可以作为特异性抗原来检测人抗GBM抗体.
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角膜内皮抗原及其抗体的提纯
目的:提纯角膜内皮抗原(corneal endothelial antigen,CEN-Ag)及抗角膜内皮抗原抗体(anti-corneal endothelial antibody,ACEN-Ab),为角膜移植排斥反应的理论研究提供基础.方法:用猪角膜内皮做抗原,上皮做对照.经离子交换层析及2B4.14.1单克隆抗体亲和层析制得纯化的CEN-Ag和角膜上皮抗原(corneal epithelial antigen,CEP-Ag).用提纯的CEN-Ag和CEP-Ag分别免疫家兔,取血清经亲和层析得到ACEN-Ab和抗角膜上皮抗原抗体(anti-corneal epithelial antibody,ACEP-Ab).结果:经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,抗原分子质量分别为43kD和53kD,相应的免疫球蛋白是IgG2和IgG3.结论:CEN-Ag和ACEN-Ab可以被提纯并从理论上证明,不同的角膜抗原和抗体穿透房水屏障的能力有所不同和角膜排斥反应的临床分型是正确的.
