首页 > 文献资料
-
黄花蒿羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶基因克隆与功能研究
青蒿素是治疗疟疾的首选药物,定位于质体的MEP途径可为青蒿素在内的萜类物质的合成提供基本前体.羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶[hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase,HDR]是MEP途径后一个酶,催化HMBPP生成IPP和IPP的同分异构体DMAPP.本文克隆了黄花蒿HDR基因(AaHDR2)并进行了相关功能研究.通过对AaHDR2基因(GenBank:KX058541)和已报道的AaHDR1基因(GenBank:ADC84348.1)表达分析结果表明:AaHDR1和AaHDR2在黄花蒿腺体中表达量均远高于在根、茎、叶和花中的表达量,而且AaHDR2在花中的表达量要明显高于叶中;MeJA和ABA能够大幅度上调AaHDR1和AaHDR2的表达,而GA3仅能大幅度上调AaHDR2的表达.据AaHDR1和AaHDR2的表达分析表明,AaHDR2对青蒿素在内的萜类物质的生物合成贡献更大,因此用AaHDR2进行后续的实验研究.生物信息学分析表明,AaHDR2属于HDR家族,进一步采用功能互补在E.coli突变体MG 1655ara＜＞HDR中证明AaHDR2编码蛋白质的确具有HDR的功能.AaHDR2亚细胞定位结果显示:AaHDR2融合GFP蛋白特异性定位于叶绿体中,符合MEP途径定位于质体的事实.采用转基因技术在拟南芥中过表达AaHDR2能显著性提高叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量.因此,本文所克隆的AaHDR2是利用代谢工程技术提高萜类物质生物合成能力的一个候选基因.
-
过表达HDR和ADS基因对青蒿素生物合成的影响
青蒿素是从草本药用植物黄花蒿(Artemisia annua L.)中分离提取的一种含有过氧桥基团结构的新型倍半萜内酯,它是世界卫生组织推荐治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的特效药物.本研究采用过表达青蒿素生物合成途径中关键酶基因的方法,培育出青蒿素含量提高的转基因黄花蒿.采用根癌农杆菌介导遗传转化方法,潮霉素抗性筛选获得同时转化HDR和ADS两个基因的转基因黄花蒿;通过基因组PCR检测确认获得了6个共转化HDR和ADS基因的转基因株系.实时荧光定量PCR检测基因表达量,结果表明转基因株系中HDR和ADS基因表达量均高于非转基因植株(仅ah3株系ADS基因表达量没有显著性提高);HPLC测定青蒿素含量结果表明转基因株系中青蒿素含量均高于非转基因植株.青蒿素含量高的转基因株系ah70中青蒿素含量为非转基因对照的3.48倍.本研究实验结果表明,过表达HDR和ADS基因在黄花蒿的代谢途径中具有提高青蒿素含量的作用,为进一步利用代谢工程技术培育青蒿素高产转基因黄花蒿提供了良好基础.
关键词： 黄花蒿 青蒿素 羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶 紫穗槐二烯合成酶 转基因
