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建泽泻法呢基焦磷酸合酶分子克隆、分布表达及生物信息学研究
三萜类化合物是道地药材建泽泻中的主要药效成分,在癌症治疗方面有很大的应用潜力.法呢基焦磷酸合酶(FPPS)为三萜类化合物合成途径中的重要限速酶之一,本文运用同源克隆和快速cDNA末端扩增(PACE)技术相结合的方法,克隆了建泽泻FPPS基因的全长cDNA(accessionn no.HQ724508),FPPS cDNA全长为1 531 bp,含有1个1 032 bp的开放阅读框,编码343个氨基酸的蛋白,包含5个保守的功能域,其中两个富含天冬氨酸(DDXXD).实时荧光定量PCR(QRT-PCR)结果显示建泽泻FPPS基因在各器官中均有表达,10月至12月上旬相对表达量呈上升趋势,后下降,其中叶片表达量较高,块茎、根、叶柄表达量相对较低.高效液相(HPLC)分析结果表明不同生长期建泽泻主要药效成分23-乙酰泽泻醇B变化趋势与FPPS基因表达量变化一致,初步证明FPPS是泽泻醇类化合物合成途径中的重要调控位点.本研究为利用植物基因工程改善中药材品质提供科学依据.
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泽泻法呢基焦磷酸合酶原核表达、功能验证及其免疫检测研究
泽泻法呢基焦磷酸合酶[farnesylpyrophosphatesynthaseofAlismaorientale(Sam.)Juzep.,Ao FPPS]是泽泻原萜烷型三萜生物合成途径中的重要限速酶之一.为进一步研究Ao FPPS基因的表达及其功能,本研究将前期获得的泽泻法呢基焦磷酸合酶基因(accessionNo.HQ724508)插入到原核表达载体,构建重组表达载体p Czn1-Ao FPPS,转化BL21原核宿主菌,经诱导表达获得融合蛋白;利用Ni树脂亲和纯化技术对融合蛋白进行纯化获得高纯度的重组蛋白,并进行体外酶促反应以验证其功能,高效液相色谱结果表明Ao FPPS能够催化法呢基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)的合成.为进一步研究其表达规律,将该纯化后的重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)检测抗体具高效价,且Westernblot结果显示该抗体可特异性识别Ao FPPS蛋白,建立了Ao FPPS的快速免疫检测方法.本研究为揭示Ao FPPS在泽泻体内的作用机制及其基因的调控与表达奠定基础,为利用植物基因工程提高泽泻资源性活性成分含量、改善中药材品质提供科学依据.
