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雷公藤鲨烯合酶基因全长cDNA克隆及诱导表达分析
根据雷公藤悬浮细胞转录组数据设计引物,克隆得到雷公藤鲨烯合酶基因TwSQS全长cDNA (GenBank:KR401220),并对其进行生物信息学分析和诱导表达分析.TwSQS cDNA全长为1 800 bp,开放阅读框为1 242 bp,编码413个氨基酸,编码的蛋白理论等电点为7.94,相对分子质量为47.20 kD.雷公藤悬浮细胞经茉莉酸甲酯(MJ)诱导后,荧光定量PCR表明TwSQS相对表达量明显上升,并于诱导后4h达到高.本研究首次克隆得到雷公藤SQS基因,为进一步解析雷公藤三萜类成分生物合成途径奠定基础.
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白花丹参HDS基因的全长克隆与原核表达分析
根据丹参转录组数据库提供的基因片段设计特异性引物,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从白花丹参中克隆1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶基因的全长cDNA序列,命名为SmHDS,GenBank注册号KJ746807.序列长度为2 529 bp,含有2 229 bp的开放阅读框,推测编码742个氨基酸,含有170 bp的5'UTR和130 bp的3'UTR.利用生物信息学软件对获得的序列进行同源性分析,得出SmHDS与紫花丹参HDS的亲缘关系较近.原核表达分析结果表明SmHDS在大肠杆菌中表达出与预测蛋白大小相当的目标蛋白,同时对影响蛋白表达的4个因素,即诱导温度、诱导时间、IPTG浓度和诱导时宿主菌的密度(A600)进行了优化,得出SmHDS蛋白表达的佳条件为:温度30℃、诱导时间20 h、IPTG终浓度0.2 mmol·L-1、宿主菌的密度(A600)值为0.6.这为进一步研究1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶在丹参酮类化合物生物合成途径中的作用提供了理论依据.
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肝癌相关基因的分子克隆和可变剪切分析
目的：：获取肝癌相关基因(hepatoma associated gene，HTA)的mRNA分子全长序列并对其可变剪接进行分析，检测其转录本在各肝癌细胞系中的表达，为进一步研究该基因在肝癌发生、发展中的作用奠定基础。方法：用3'RACE和5'RACE方法扩增HTA基因的全长序列并对其序列信息和可变剪接进行扩增和测序分析，用Northern印迹检测该基因转录本在不同肝癌和正常肝细胞系中的表达。结果：HTA基因全长序列为1414 bp，经分析该序列包含3个外显子，2个内含子，其中2号内含子在可变剪接中被作为外显子表达。Northern印迹显示HTA基因1.7 kb转录本和1.4 kb转录本均表达于恶性肝癌细胞系，而不表达于正常细胞系。结论：成功获得了HTA基因的全长序列并对其可变剪接进行了分析，2个大小不同的转录本均在肝癌细胞系中特异性表达，作为一个肝癌相关基因值得进一步深入研究。
