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微小RNA-221／222海绵体载体的构建及验证
目的：构建微小RNA（miR）-221／222海绵体载体并初步探讨其在口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞中的作用。方法利用miRNA海绵体技术设计合成含3个has-miR-221和3个has-miR-222反义序列的DNA片段，经酶切连入pDC316-mCMV-EGFP质粒载体，合成miR-221／222海绵体载体。将miR-221／222海绵体载体转染入OSCC细胞系UM1，检测转染效率，实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测miR-221和miR-222表达水平，Western blot检测转染后PTEN蛋白表达水平，Transwell实验检测细胞的侵袭能力。结果成功构建miR-221／222海绵体载体，测序验证与设计序列完全一致；UM1各组细胞转染效率均在70％以上；实时荧光定量PCR显示，miR-221／222海绵体载体组miR-221和miR-222表达水平较pDC316质粒组和UM1细胞组明显降低（t1=111.69，P1=0.001；t2=6.98，P2=0.002；t3=236.55，P3=0.001；t4=22.06，P4=0.001）；Western blot显示，海绵体转染组较对照组PTEN蛋白水平表达明显升高；Transwell实验显示，海绵体转染组细胞侵袭能力较对照组减弱。结论实验成功构建了miR-221／222海绵体载体，并初步验证其对OSCC细胞侵袭性的抑制作用，为后续miR-221／222的功能研究奠定基础。
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hsa-miR-26b沉默载体的构建及验证
目的 构建hsa-miR-26b沉默载体,与其靶基因PTEN共转染HEK-293T细胞验证其沉默效果.方法 用miRNA海绵体技术设计并合成与hsa-miR-26b成熟序列反向互补的3个重复序列的双链DNA,将短发卡状RNA(shRNA)克隆入LV3-GFP-Puro载体,与靶基因PTEN共转染HEK-293T细胞,于24 h后收集细胞RNA,用real-time PCR检测hsa-miR-26b表达水平,同时用双荧光素报告系统检测其对靶基因的作用.结果 成功构建了有效的hsa-miR-26b沉默载体,经测序验证与设计序列一致；real-time PCR验证hsa-miR-26b表达水平降低了75％；双荧光素报告系统验证其对靶基因无抑制作用(P＞0.05).结论 成功构建hsa-miR-26b沉默载体,并验证其对靶基因PTEN无抑制作用.
关键词： hsa-miR-26b 海绵体载体 双荧光素报告系统 人脂肪细胞
