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BimS真核质粒过表达载体构建及诱导ACC-2细胞凋亡作用
目的 构建BimS真核质粒过表达载体及鉴定并转染ACC-2细胞,观察其在细胞中上调BimS蛋白表达及促凋亡作用.方法 根据人BimS基因设计引物,扩增目的基因片段,挑选阳性克隆,分别采用PCR扩增电泳和DNA测序鉴定.分为对照组和实验组将构建的质粒表达载体转染ACC-2细胞,通过定量PCR和Western biot检测其基因和蛋白相对表达水平,检测细胞凋亡率和超微结构的变化.结果 实验组细胞凋亡明显,凋亡率为(29.6±0.3)％;对照组细胞凋亡率仅为(0.83±0.2)％,实验组与对照组细胞凋亡率比较具有统计学差异(Pp＜0.05).电镜下实验组细胞呈典型的细胞凋亡形态学改变,对照组细胞形态未发生变化.结论 BimS真核质粒过表达载体构建成功,并能显著上调ACC-2细胞中BimS mRNA、蛋白表达及诱导细胞凋亡.
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前凋亡因子bimS基因的重组腺病毒载体构建
为探讨前凋亡因子bimS用于肿瘤基因治疗奠定基础,拟构建bimS的重组腺病毒载体.采用RT-PCR方法从人HL-60细胞扩增目的基因bimS;克隆至T载体测序正确.亚克隆bimS基因到腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV上,形成含目的基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的穿梭载体.穿梭载体pAdtrack-CMV-bimS和病毒骨架载体pAdEasy-1经电穿孔法转入BJ5183大肠杆菌中行同源重组,获得重组pAdEasy-CMV-bimS,线性化后脂质体法转染人胚肾(HEK)293细胞进行病毒的包装、扩增、病毒滴度测定以及瞬时表达的观察;将病毒以MOI＝100感染HEK293细胞,western blot检测bimS蛋白表达.结果显示病毒感染293细胞48～72 h观察到GFP表达,7 d出现典型细胞病变症状(CPE);提取培养上清中病毒DNA,以PCR法可检测到bimS的扩增产物;western blot检测病毒感染的293细胞总蛋白,与未感染的阴性对照细胞相比,bimS蛋白表达明显高于阴性对照细胞.表明重组bimS腺病毒构建成功;为进一步进行肿瘤基因治疗的体内外试验奠定基础.
