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OPTN基因的低表达对大鼠视网膜神经节细胞存活影响的研究
目的 观察大鼠OPTN基因的低表达对视网膜神经节细胞系(RGC5)亚细胞形态结构及存活的影响.方法 实验研究.设计并合成特异性针对Sprague-Dawley(SD)大鼠OPTN的3对RNA干扰片段(siRNA),体外培养SD大鼠星型胶质细胞,取对数生长期的细胞做实验,分别将3对siRNA(si-OPTN-001、si-OPTN-002、si-OPTN-003)通过脂质体Lipofectemine 2000转染入星型胶质细胞,24 ～ 48 h后采用实时PCR和Western Blot检测siRNA的干扰效果,筛选出抑制效果佳的序列;以筛选出来的siRNA序列构建绿色荧光蛋白EGFP标记的si-OPTN,并通过Lipofectemine 2000包裹转染RGC5,将RGC5分为4组:空白对照组,绿色荧光蛋白真核细胞表达载体(pEGFP)阳性对照组,si-OPTN组,脂质体阴性对照组.转染24～48 h后用细胞器特异荧光染料标记细胞内不同细胞器结构,通过共聚焦荧光显微镜来观察表达的si-OPTN在RGC5内的分布、定位及其对细胞器形态结构的影响;通过形态学观察和Hoechst33342-PI荧光染色观察si-OPTN对RGC5存活的影响.实验中不同组间的总体比较采用单因素方差分析.结果 实时PCR及Western Blot的结果显示:转染si-OPTN-001、si-OPTN-002和si-OPTN-003 24 h后星型胶质细胞内OPTN的mRNA表达下降,分别为阴性对照组的(61.71±0.84)％、(48.13±0.92)％和(46.22±0.73)％,而转染si-OPTN-001、si-OPTN-002和si-OPTN-003 48 h后星型胶质细胞内OPTN的蛋白表达水平下降,分别为阴性对照组的(64.44±2.01)％、(57.78±1.97)％和(37.78±1.84)％,其中si-OPTN-003与阴性对照组相比降低显著;si-OPTN转染RGC5细胞24 h后的转染效率为(17.43±0.94)％;转染48 h后的转染效率为(20.13±1.24)％;表达的si-OPTN在细胞内基本上均匀分布于整个细胞,覆盖胞质和胞核,与阴性对照组细胞器染色情况比较,转染细胞内的肌丝蛋白、线粒体、溶酶体及高尔基体形态结构未见明显损伤性改变;Hochest33342/PI荧光染色结果显示:转染24 h,与空白对照组(0.74±0.34)％和阴性对照组(0.96±0.41)％比较,EGFP阳性对照组及si-OPTN组整组的RGC5细胞凋亡率均增加,差异有统计学意义(F=5.457,P＜0.05),但si-OPTN组转染质粒的细胞凋亡率明显低于阳性对照组,差异有统计学意义(F=6.541,P＜0.05).随转染时间延长,在转染48 h时,阳性对照组凋亡率较24 h时下降,si-OPTN组凋亡率稍升高但无统计学意义(F=3.212,P＞0.05),且仍低于阳性对照组.结论 相较于另2对si-RNA,si-OPTN-003更能有效地抑制OPTN的表达;si-OPTN转染RGC5后均匀分布于全细胞,对细胞内的亚细胞器结构未见明显损伤性改变;通过转染si-OPTN使OPTN表达降低可能对RGC5的存活有保护作用.
