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18SrRNA在系统进化研究中的应用
本文简要介绍了18srRNA的结构特点、功能及在系统进化研究中的应用,并就目前应用18srRNA所做的一些工作做了简要总结.
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河南猪株旋毛虫18S rRNA基因的同源性序列分析
目的 通过分析18S rRNA基因序列同源性,对河南猪株旋毛虫进行分子鉴定及分类. 方法 收集河南猪株旋毛虫成虫,提取总RNA,反转录合成cDNA,经特异引物扩增获得18S rRNA基因片段.将此目的基因与pMD18-T载体连接,转化大肠埃希菌感受态细胞,阳性克隆经PCR及酶切鉴定后进行序列测定及分析,构建系统发育树. 结果 构建的重组质粒酶切片段大小分别为2 700和1 800 bp,与预期值相符.根据18S rRNA碱基序列构建系统发生树,河南猪株旋毛虫与虫株Trichinella nativa (AY487254.1)的亲缘关系较近,同源性为99.1％. 结论 河南猪株旋毛虫归属于T2.
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环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫的研究
目的 用环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫.方法 提取牛粪中隐孢子虫卵囊DNA.根据隐孢子虫18S rRNA序列及环介导等温扩增(100p-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的原理,设计4条隐孢子虫特异引物,利用LAMP检测牛粪中隐孢子虫卵囊DNA和蓝氏贾第鞭毛虫DNA,以正常牛粪DNA为阴性对照.LAMP产物经SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性,对LAMP产物进行电泳分析,观察其特征条带的情况.结果隐孢子虫卵囊DNA检测管经显色后时不再呈绿色,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA呈棕色.隐孢子虫LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA无扩增产物.结论 LAMP方法敏感、特异、简便,可用于检测牛粪中的隐孢子虫.
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贝氏隐孢子虫PCR检测试剂盒的研制
目的 研制禽类贝氏隐孢子虫的PCR检测试剂盒.方法 根据贝氏隐孢子虫18S rRNA和ITS-1序列,选取遗传标记位点多的一段核苷酸序列作为特异PCR引物的靶序列,设计、合成了一对针对贝氏隐孢子虫的特异性引物 (YJWF:5'-ACTGATATACAATACCACGG-3'和YR:5'-GCGGATAAAGTTCAGGTTC-3'),对PCR反应条件进行了一系列优化,并分别对试剂盒的特异性、敏感性、稳定性、重复性和保存期等进行了系列研究.结果 该试剂盒能特异性地扩增出贝氏隐孢子虫基因组中相应片段,与安氏隐孢子虫,微小隐孢子虫,柔嫩艾美尔球虫等相关原虫基因组DNA无交叉反应;低能检测到3.48个卵囊;反复冻融50次对试剂盒没有影响;室温条件下至少可保存4个月.结论 该试剂盒的各项指标达到了贝氏隐孢子虫的检测要求.
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香鳞毛蕨18S rRNA基因片段的克隆与序列分析
目的 研究药用植物香鳞毛蕨核糖体18SrRNA基因的序列特征.方法 以香鳞毛蕨总RNA为模板,根据蕨类植物18S rRNA保守区域设计引物,对香鳞毛蕨18 SrRNA基因进行基因克隆、测序、并进行序列比对和同源性分析.结果 克隆获得香鳞毛蕨18S rRNA 1010bp部分片段(GenBank登录号GU385474),进行Blast对比发现其与大羽鳞毛蕨的同源性达到99％.结论 DNA测序技术可为香鳞毛蕨的鉴定提供准确而有效的分子鉴定方法,也可为其药用成分相关基因的研究提供基础性资料.
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18srRNA作为内参在肺癌相关基因LSCC-3研究中的应用
目的:利用以18srRNA为内参照系统的半定量RT-PCR方法对肺癌相关基因LSCC-3在肺癌组织和正常肺组织中的差异表达进行研究并探讨18srRNA作为内参照系统的可行性及其系统优化.方法:分别提取肺癌组织和癌旁正常肺组织共计50对标本的总RNA,根据人肺癌相关基因LSCC-3和人18srRNA序列分别设计引物,以18srRNA作为内参照物进行双扩增RT-PCR反应,对反应体系及过程进行优化并分别进行三次反应,三次反应产物经琼脂糖凝胶电泳后以凝胶成像分析系统行半定量分析,并对结果进行统计学处理.结果:经优化反应系统,以18srRNA作为内参照物的半定量RT-PCR反应结果稳定、三次反应结果经t检验显示差异无统计学意义(P>0.05);经配对t检验,人肺癌相关基因LSCC-3在肺癌组织中表达上调,与癌旁正常组织间存在明显的差异表达(P<0.005),与同期进行的Northern blot实验结果完全符合.结论:由于18srRNA在各种不同功能状态的不同细胞内的量的相对稳定,经过优化条件,以18srRNA作为内参照物的半定量RT-PCR系统的结果是稳定、可信的.
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食品和水源微小隐孢子虫18S rRNA鉴定方法研究
目的了解生蔬食品及相关水源微小隐孢子虫污染情况,并研究其卵囊分离及18S rRNA鉴定的方法. 方法采用分步离心富集法从78份生蔬食品和相关水源中分离出微小隐孢子虫卵囊并提取DNA模板,利用微小隐孢子虫18S rRNA 的基因序列设计特异性引物(446bp)进行多聚酶链反应扩增,扩增产物经回收克隆后进行PCR鉴定、酶切鉴定及序列同源性分析. 结果从78 份样品中检出4份特异性条带样品.限性样品的重组克隆经PCR鉴定可重现446bp的特异性条带,其酶切产物亦与目的基因PCR产物位置相同.重组菌液的测序结果与Geabank数据库中微小隐孢子虫18S rRNA基因序列的同源性为99%. 结论建立了一种监测生蔬食品及相关水源中微小隐孢子虫污染的基因检测方法.
