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听觉损伤后毛细胞再生与聋病基因治疗策略
听觉损伤可引起耳蜗毛细胞和听觉神经元的不可逆性损伤,从而导致永久性的感音神经性耳聋.虽然内耳所独具的结构是基因治疗非常独特和重要的靶器官,但能否实现损伤后毛细胞的再生是其前提条件.国内外研究者们做了大的探索并取得重要突破,从非哺乳动物到哺乳动物毛细胞再生,从前庭毛细胞到耳蜗毛细胞再生,从未成熟期到成年期毛细胞再生,从离体培养毛细胞再生到在体毛细胞再生,整整经历了近半个世纪.但是毛细胞的再生并不等同于听力完全恢复.针对内耳基因治疗时间窗问题,我们根据听觉损伤后不同的病理状态,提出听觉损伤后毛细胞再生和基因治疗的基本策略:(1)毛细胞纤毛损伤阶段,是基因治疗的好时机,通过完全修复或纤毛再生达到功能的完全或部分恢复;(2)内耳毛细胞虽有损伤但没有坏死,支持细胞和神经纤维基本正常,所以有恢复形态和功能的机会,这个阶段导入Math1基因应该有效,是基因治疗的关键时机;(3)毛细胞严重损伤但支持细胞尚存,是毛细胞再生的抢救阶段,而且还可以争取在Corti器细胞构架没有塌陷之前进行干细胞导入,所以这个阶段内细胞移植可能有效地实现听力恢复;(4)Coni器完全失去构架,仅仅残留上皮层或瘢痕化,基因导入完全无效,即使十细胞导入也会面临困难,如何重塑Corti器构架是巨大挑战.为了实现耳聋基因治疗临床应用的可能性,我们还探索了有效简便的外源基因内耳导入方式以及高效安全可靠的基因载体比如纳米载体的研发.毛细胞再生研究已经取得突破性进展,但还面临诸多挑战.通过不懈的努力,聋病基因治疗的终临床应用一定会实现.
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Math1基因联合神经生长因子β基因共转染对噪声性听力损伤豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用
目的 观察Math1(mouse atonal homologue 1 gene,Math1)基因及神经生长因子β基因(nerve growth factor beta gene,NGFβ)共转染对噪声性听力损伤豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用.方法 选用40只健康成年白色纯种豚鼠制备稳态噪声(110 dB SPL)耳聋模型,任选爆震前后听阈阈移大于60 dB SPL的动物作为实验动物,共选35只,采用数字表法随机分为4组,其中Ⅰ组10只为双基因组,导入腺病毒介导的双基因Ad-Math 1/NGFβ;Ⅱ组10只为Math1组,导入腺病毒介导的单基因Ad-Math1;Ⅲ组10只为NGF组,导入腺病毒介导的单基因Ad-NGFβ;Ⅳ组5只为对照组,导入腺病毒;另选健康成年白色纯种豚鼠5只为正常组,不接受噪声和基因转染.基因转染后第1周,取豚鼠耳蜗组织固定切片行免疫组织化学染色;基因转染后第4周,取豚鼠耳蜗组织固定切片行HE染色.结果 基因转染后1周,Ad-Math 1/NGFβ在豚鼠耳蜗内成功转染,耳蜗各回膜性组织中均有表达,且表达强度基本相等;基因转染后第4周HE染色显示:Ⅰ组豚鼠耳蜗组织中螺旋神经节细胞数平均为(166.4 ±2.58)个,明显多于Ⅱ组(92.1±1.34)个、Ⅲ组(88.6±1.22)个,差异均有统计学意义(P＜0.01),且细胞形态与正常细胞形态相近.结论 Math1联合NGFβ基因共转染在噪声损伤后豚鼠耳蜗中高效表达,对噪声性听力损伤豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞有明显的保护作用.
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Math1/神经生长因子β基因共转染对噪声性听力损伤豚鼠耳蜗毛细胞的保护作用
目的 观察Math1基因(mouse atonal homologue 1 gene,Math1)及神经生长因子β基因(nerve growth factor beta gene,NGFβ)共转染对噪声性听力损伤豚鼠耳蜗毛细胞的保护作用.方法 选用35只白色纯种豚鼠,制备豚鼠稳态噪声耳聋模型(110 dB SPL),噪声暴露前后分别行听觉脑干电位(auditory brainstem response,ABR)检测,选择噪声暴露前后听阈阈移大于60 dB SPL的豚鼠.采用数字表法随机分为4组,其中A组10只,为双基因组(导入目的基因Ad-Math 1/NGFβ);B组10只,为Math1组(导入目的基因Ad-Math1);C组10只,为NGF组(导入目的基因Ad-NGFβ);D组5只,为对照组(导入空病毒).基因转染后,进行ABR反应阈测定、免疫荧光染色检测基因蛋白表达,并用电镜扫描观察耳蜗毛细胞.结果 基因转染后1周,Ad-Math1/NGFβ、Ad-Math1、Ad-NGFβ在豚鼠耳蜗内成功转染,耳蜗各回膜性组织均有表达,强度基本相等;A组双基因转染豚鼠ABR反应阈恢复显著快于B、C组单基因转染豚鼠ABR反应阈;转染后2周,A组豚鼠ABR[(37.6±2.8) dB SPL]已基本恢复正常,而B、C组豚鼠ABR[(45.3±2.5) dB SPL及(47.5±3.1) dB SPL]没有恢复正常,D组豚鼠ABR没有恢复[(75.7±3.4)dB SPL],A组与其他3组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).扫描电镜示:噪声暴露后可见各组豚鼠耳蜗毛细胞静纤毛融合及缺失;基因转染后1周,A组豚鼠耳蜗可见新生毛细胞出现,其他组豚鼠耳蜗未见新生毛细胞;转染后2周,A组豚鼠耳蜗新生毛细胞数量增加,B、C、D组豚鼠耳蜗未见新生耳蜗毛细胞.结论 Math 1/NGFβ基因共转染在噪声损伤后豚鼠耳蜗中能高效表达,对噪声性听力损伤的保护作用明显优于单基因转染.
