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原核表达并纯化沙眼衣原体(Ct)巨噬细胞感染增强因子MIP的免疫活性分析
目的 原核表达并纯化沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)巨噬细胞感染增强因子MIP,评价其作为Ct疫苗候选蛋白的可行性.方法 采用PCR技术从Ct D型基因组中扩增MIP基因,构建pGEX-6p-1/MIP原核表达质粒,转化E.coli XLl-Blue,IPTG诱导重组GST-MIP融合蛋白表达,经酶切后得到无GST标签的纯蛋白免疫Balb/c鼠,ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体和脾细胞因子的产生情况.结果 成功构建了pGEX-6p-1/MIP原核表达质粒,序列测定证实重组质粒插入片段与GenBank登陆的Ct D型一致,长度为729 bp;GST-MIP融合蛋白在E.coli中获得稳定高效表达,纯化后纯度达90％以上;MIP蛋白免疫小鼠产生高滴度、高特异性的IgG抗体,以IgG2a亚型为主;MIP蛋白免疫小鼠的脾细胞受衣原体菌体或MIP蛋白刺激,产高水平IFN-γ.结论 原核表达并纯化了Ct MIP蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生高滴度抗体和Thl型免疫应答,可能为潜在有效的Ct亚单位疫苗.
关键词： 沙眼衣原体 巨噬细胞感染增强蛋白 克隆表达 纯化 疫苗 -
嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强蛋白的表达和纯化及其在血清学诊断中的应用
目的 表达和纯化出嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强(MIP)蛋白,研究其在军团菌肺炎血清学诊断中应用价值.方法 将已构建成功的重组质粒pET-mip转化E.coli BL21感受态细胞,诱导MIP蛋白表达,运用SDS-PAGE分析和亲和层析法纯化.用DRG军团菌IgG/IgM/IgA的ELISA检测试剂盒筛出40份阳性血清和30份阴性血清,用纯化的MIP蛋白建立间接ELISA,同时与R＆D的ELISA IgG、IgM、IgA试剂盒分别检测已筛选血清中的IgG、IgM、IgA抗体,然后对这两种方法进行比较,通过敏感性、特异性以及不同检测结果的一致性,来评价该方法的应用价值.结果 诱导相对分子质量(Mr)大约40 000的MIP融合蛋白在E.coli BL21中表达并纯化.纯化蛋白建立的间接ELISA分别检测筛选血清中IgG、IgM、IgA抗体与国外ELISA试剂盒(R＆D)进行比较,IgG抗体的灵敏度88.5％,特异度95.5％,一致性Kappa值0.846(P ＜0.05),ROC曲线下面积0.927.IgM抗体的灵敏度89.3％,特异度97.6％,一致性Kappa值0.88(P ＜0.05),ROC曲线下面积0.947.IgA抗体的灵敏度90％,特异度95.2％,一致性Kappa值0.856(P＜0.05),ROC曲线下面积0.931.结论 成功诱导了嗜肺军团菌MIP蛋白稳定表达并纯化,运用MIP作为包被抗原的军团菌肺炎的血清学诊断方法具有较高的诊断价值.
关键词： 嗜肺军团菌 巨噬细胞感染增强蛋白 蛋白表达 血清学诊断
