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异种(猪)脱细胞真皮基质粉对表皮细胞和成纤维细胞的促进作用
目的 观察冷冻研磨获得的脱细胞真皮基质粉(ADMP)生物学性状,探索高纯度且保留生物活性的异种(猪)ADMP对表皮细胞和成纤维细胞生长的支持及在皮肤创伤修复中的应用.方法 选取幼龄长白猪背部皮肤,经生物酶法脱细胞、冷冻干燥后经过不同冷冻研磨程序得到异种(猪)ADMP,再由60钴辐照获得无菌异种(猪)ADMP;通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察异种(猪)ADMP颗粒大小及胶原形态,确定适合应用的研磨程序;通过MTT法检测HaCaT细胞和BJ人皮肤成纤维细胞在不同浓度异种(猪)ADMP包被下的黏附作用,确定异种(猪)ADMP实现细胞大黏附的浓度范围;DMEM培养液基添加异种(猪)ADMP为实验组,单纯DMEM培养液基为对照组,使用实时细胞分析技术分析BJ人皮肤成纤维细胞迁移指数,验证异种(猪)ADMP对成纤维细胞的促迁移作用;原代表皮细胞接种在异种(猪)ADMP培养液8d,绘制增殖曲线,检测异种(猪)ADMP对原代表皮细胞的促增殖作用,同时免疫荧光检测原代表皮细胞表面成熟与分化蛋白的表达.对数据进行Student's t-检验.结果 1、2、3、5、7、10次循环研磨获得异种(猪)ADMP,肉眼可见全部为白色、无块状,其中1、2、3次循环呈较粗颗粒;5、7、10次循环呈现集中均匀趋势,粒径分布在0 ～12 μm之间.其中5次循环粒径(13.00±2.10) μm与7次循环[(6.00±0.96)μm比较,差异有统计学意义(t=6.093,P=0.0002).异种(猪)ADMP透射电子显微镜下发现,不同循环次数获得的异种(猪)ADMP均能保留大量胶原分子.BJ人成纤维细胞和HaCaT细胞随包被浓度的增加,细胞黏附作用不断增强,浓度高于750 μg/cm2,无明显变化.实时细胞分析技术检测BJ人皮肤成纤维细胞在DMEM培养液基对照组培养液72 h后的迁移指数为1.21 ±0.10,而异种(猪)ADMP培养液基试验组的迁移指数为3.66 ±0.11,两组比较差异有统计学意义(t=22.24,P=0.002).在异种(猪)ADMP培养液的原代表皮细胞形态统一增殖迅速,对照组出现一定比例的分化细胞,试验组与对照组第5天细胞数分别为(4.11±0.28)×105、(1.10±0.12)×105个,两组比较差异有统计学意义(t=13.51,P=0.005);第8天细胞数分别为(5.00±0.48) ×105、(3.05 ±0.30)×105个,两组比较差异有统计学意义(t=4.87,P=0.039),增殖曲线显示试验组在接种即日培养液至第5天,一直处于指数增长期.荧光染色中异种(猪)ADMP培养液的原代表皮细胞E-cad全部表达,少量表达角蛋白10,整合素α6几乎全部强阳性,角蛋白14全部表达并有部分强阳性,Ki-67抗原表达率高.结论 通过生物酶解和冷冻研磨获得的异种(猪)ADMP对参与皮肤创伤修复重要的表皮细胞和成纤维细胞,具有促进其增殖和迁移的作用,未来可进一步应用于皮肤创伤修复.
