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ULBP3基因转染提高人外周血NK细胞对人成骨肉瘤Saos-2细胞的杀伤活性
目的观察ULBP3基因转染对人外周血NK细胞对Saos-2细胞杀伤活性的影响.方法用RT-PCR方法从人成骨肉瘤组织中提取ULBP3基因,构建pcDNA3真核表达质粒,以Lipofectamine为载体转染人成骨肉瘤Saos-2细胞,用percoll密度梯度离心法分离人外周血NK细胞作为效应细胞,以Saos-2细胞和转染ULBP3基因的Saos-2细胞作为靶细胞,进行体外杀伤实验,比较两组的特异性杀伤率.结果在效靶比为30:1时人外周血NK细胞对转染ULBP3基因的Saos-2细胞的特异性杀伤率明显高于对照组.结论ULBP3基因转染能提高人外周血NK细胞对人成骨肉瘤Saos-2细胞的杀伤活性.
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ULBP3胞外段基因的克隆与表达
目的为了研究ULBP3刺激NK细胞增殖分化的功能,首先需构建、表达ULBP3胞外段重组蛋白.方法用RT-PCR方法从人结肠癌组织中钓取ULBP3胞外段基因,构建pET32a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导表达,Western blot鉴定.结果经测序证实,所获得的cDNA克隆为ULBP3胞外段基因,其序列与genebank中已经发表的序列完全一致,pET32a原核表达载体转化大肠杆菌BL21后,经筛选获得的阳性重组菌稳定表达ULBP3胞外段重组蛋白.结论成功表达了ULBP3胞外段重组蛋白,可用于进一步研究ULBP3刺激NK细胞增殖分化的功能.
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ULBP3胞外段分子伴侣10融合蛋白的构建与表达
[目的] 研究ULBP3基因的功能,构建、表达ULBP3胞外段分子伴侣10重组融合蛋白.[方法] 将ULBP3胞外段cDNA连接在重组原核表达质粒pET28a-chaperonin10中chaperonin10基因的下游,构建chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Western blot 鉴定.[结果] 酶切鉴定证实,chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体构建正确,该原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经筛选获得的阳性重组菌稳定表达chaperonin10-ULBP3重组融合蛋白.[结论] 成功表达了ULBP3胞外段重组融合蛋白,可进一步用于ULBP3功能实验研究.
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人UL16结合蛋白3的原核表达及其多克隆抗体制备
目的:表达和纯化人UL16结合蛋白3(ULBP3)胞外段融合蛋白,制备兔抗人ULBP3多克隆抗体.方法:利用PCR技术获得人ULBP3分子胞外段的基因编码序列,并将其亚克隆至原核表达载体pQE30,构建出重组表达质粒pQE30-ULBP3( aa30-171).测序鉴定正确后转化人大肠杆菌感受态细胞M15,经IPTG 30℃诱导4h后,SDS-PAGE显示融合蛋白(表达产物)以包涵体形式存在.用镍柱对融合蛋白进行纯化,将纯化的蛋白免疫新西兰白兔,采用流式细胞术(FCM)、Western blot法和免疫组化染色对所得多克隆抗体的生物学特性进行鉴定.结果:成功表达及纯化了人ULBP3( aa30-171)重组蛋白.结果显示该多克隆抗体能够识别大肠癌细胞株COL0205表面表达的天然构象ULBP3分子,而且能与结直肠癌组织细胞的ULBP3分子结合.结论:成功构建了原核表达载体pQE30-ULBP3(aa30-171),并获得高纯度的人pQE30-ULBP3(aa30-171)重组蛋白；成功制备了兔抗人ULBP3分子的多克隆抗体.
