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自杀载体文献资料
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布鲁氏菌自杀载体的改建及其在突变株构建中的应用
目的:改建布鲁氏菌自杀载体.方法:用Nde Ⅰ将pKOBEG-SacB质粒中的反向筛选基因sacB切下来,与同样酶切处理的pUC19质粒连接,得到pUC19-SacB,经测序和蔗糖筛选实验证实.结果:成功将SacB从pKOBEG-SacB中切下来并插入到pUC19质粒中,构建得到了pUC19-SacB.测序和蔗糖筛选实验证实,插入的sacB基因具有较好的反筛功能.我们利用该质粒,成功的构建了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统的突变株,改建的载体能高效的应用于布鲁氏菌染色体的精确修饰.结论:构建了一个新的自杀质粒pUC19-SacB,该质粒能用于布鲁氏菌无痕缺失突变株的构建.
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肺炎克雷伯菌基因无痕敲除方法的建立
目的 建立可行的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)基因无痕敲除方法.方法 PCR扩增得到目的基因上下游同源臂融合片段,将其克隆到自杀载体pKO3-km,构建重组质粒.提取重组质粒,通过电转化转入肺炎克雷伯菌NTUH-K2044中,在43℃条件下培养筛选得到重组质粒整合到细菌基因组上的重组子,再利用质粒pKO3-km上的sacB基因在含蔗糖的平板上反向筛选得到突变株.结果与结论 成功构建突变株,且突变株基因组上没有任何抗性筛选标记残留.该研究为肺炎克雷伯菌基因功能研究提供了基因敲除技术.
