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腺相关病毒载体介导乳腺癌BA46基因转移的实验研究
目的评价腺相关病毒(AAV)为载体介导乳腺癌BA46基因转导树突状细胞(DC)的可行性. 方法构建重组质粒d16-95/BA46p5/NeoSV40(简称rAAV/BA46/Neo),并制备该病毒.分离外周血单核细胞(DC前体细胞),采用GM-CSF、IL-4、TNF-α诱导,以rAAV/BA46/Neo病毒感染DC前体细胞,感染后72 h,流式细胞仪检测rAAV/BA46/Neo病毒感染效率及BA46表达情况,6 d后,RT-PCR分析BA46 mRNA转录情况,PCR/Southern blot分析BA46基因染色体整合情况. 结果 AAV成功介导BA46基因转导DC,BA46在DC内良好表达,病毒基因整合入DC基因组内. 结论 AAV载体成功介导BA46基因转导DC,为以DC为基础的乳腺癌的基因治疗打下基础.
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BA46基因转染树突状细胞治疗乳腺癌的研究
目的探讨以乳腺癌特异抗原BA46基因转导树突状细胞(DC)治疗乳腺癌的可行性. 方法取健康人外周血,采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞(DC前体细胞),以AIM-V培养基于6孔板培养,贴壁5 h,轻轻洗去悬浮细胞(T细胞,冻存备用),取贴壁细胞,将细胞分为基因转染组及对照组,基因转染组感染携带BA46基因的重组腺相关病毒rAAV/BA46/Neo,对照组以293细胞冻融液刺激,两组细胞均采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导DC前体细胞成熟.第7天,收集悬浮细胞(DC),显微镜观察细胞形态,流式细胞仪分析DC的表面标志CD80、CD86、CD40的表达情况;另取该DC与T细胞按1∶20比例混合,含5%人血清蛋白的AIM-V为培养基,同时加入IL-2与GM-CSF,共育7 d,诱导获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL),取BA46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T为靶细胞,采用51Cr释放法测量杀伤效率,同时以流式细胞仪检测CTL群体中CD8/CD4和CD8/CD56的比值. 结果 BA46基因转导的DC表面标志CD80、CD86、CD40的表达均明显高于对照组DC,所激活的T细胞对BA46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T有很好的杀伤效果,此杀伤具有抗原特异性和MHC限制性,且该T细胞中CD8/CD4和CD8/CD56的比值均明显高于对照组(细胞裂解物冲击DC所激活的T细胞). 结论 BA46基因转染成功制备DC,并诱导特异的CTL,为乳腺癌的DC基因转染疗法打下基础.
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rAAV/BA46转染树突状细胞诱导特异细胞免疫
目的 探讨以腺相关病毒为载体,乳腺癌抗原BA46基因转染树突状细胞(DC)诱导特异细胞免疫的可行性.方法 取健康人外周血,采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(DC前体细胞),将细胞分为基冈转染组及对照组,基因转染组以重组腺相关病毒rAAV/BA46/Neo转染,对照组以293细胞裂解物冲击.两组细胞均采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导DC前体细胞成熟.第7天,收集DC,取该DC与T细胞按比例混合,诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL),用3H-TdR掺入法检测DC刺激自体淋巴细胞增殖能力;以流式细胞仪分析CTL细胞中IFN-γ、IL-4、CD4、CD8、CD25、CD69的表达情况,同时取BA46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T为靶细胞,采用51Cr释放法检测杀伤效率.结果 BA46基凶转染组DC具备较强的刺激淋巴细胞增殖的能力,所诱导的CTL高表达CD8、CD69和IFN-γ,对BA46阳性的靶细胞有较强的杀伤作用,该杀伤具有BA46抗原特异性和MHC限制性.结论 乳腺癌BA46基因转染DC成功诱导特异的细胞免疫.为基因修饰细胞治疗乳腺癌打下实验室基础.
