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大肠杆菌重组LTKA63突变体和LTB黏膜免疫佐剂活性的研究
目的构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位(heat-labile enterotoxin subunit A,LTA)突变体LTKA63及B亚单位(heat-labile enterotoxin subunit B,LTB)基因原核表达系统,确定rLTKA63和rLTB黏膜免疫佐剂活性.方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA和LTB基因,采用定位突变技术构建LTKA63突变体,T-A克隆后测序.构建LTKA63和LTB原核表达载体,采用SDS-PAGE鉴定表达产物.采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径,以GM1-ELISA检测rLTB结合牛GM1的能力.建立幽门螺杆菌SS1株小鼠感染模型,分别以幽门螺杆菌(Hp)重组尿素酶B亚单位(rUreB)和黏附素(rHpaA)为抗原,分别检测rLTKA63和rLTB对rUreB和rHpaA的免疫保护增强作用.结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA和LTB基因条带.LTA基因定位突变后获得序列正确的LTKA63突变体.rLTKA63和rLTB表达量分别占细菌总蛋白的30%和20%左右.LTKA63作用后TH1和TH2细胞较阴性对照组分别增加19.9%和42.3%,GM1-ELISA结果证实rLTB能与牛GM1结合.33.3%(4/12)rUreB和41.7%(5/12)rHpaA免疫小鼠胃黏膜标本中分离出幽门螺杆菌,且rUreB和rHpaA特异性S-IgA检测结果均为阴性.rUreB或rHpaA加用rLTKA63或rLTB免疫后,小鼠胃黏膜标本中幽门螺杆菌分离阳性率下降为16.7%～25.0%(P＞0.05),rUreB和rHpaA特异性S-IgA阳性率可达41.6%～58.3%(P＜0.01).结论成功地构建了LTKA63和LTB原核表达系统,所表达的rLTKA63和rLTB均具有较强的黏膜免疫佐剂活性.
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大肠杆菌LTKA63突变体的构建及重组LTKA63免疫佐剂活性机理的研究
目的构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位(heat-labile enterotoxin subunit A, LTA)基因减毒突变体LTKA63及其原核表达系统,探讨重组LTKA63(rLTKA63)粘膜免疫佐剂活性的机制.方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA基因,利用定位突变技术构建LTKA63突变体,T-A克隆后测序.采用无His-tag的原核表达载体pET-15b,构建LTKA63原核表达系统,通过SDS-PAGE鉴定表达产物.采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径.结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA基因条带.与报道的LTA序列比较,所克隆的LTA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.03%～99.61%和98.33%～99.22%.LTA基因定位突变后获得序列正确的LTKA63突变体.rLTKA63表达量占细菌总蛋白的15%左右.rLTKA63作用后Th1和Th2细胞较阴性对照组分别增加21.9%和36.2%.结论本文成功地构建了LTKA63原核表达系统,所表达的rLTKA能同时激活Th1和Th2细胞.
