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登革2型病毒E基因DⅢ区的原核表达及血清学诊断应用
目的 表达登革2型病毒E基因DⅢ区重组蛋白并应用于血清登革病毒IgM抗体检测.方法 构建包含登革2型病毒E基因DⅢ区片段的重组表达质粒,并在E.coli BL21(DE3)中表达,利用重组蛋白建立间接ELISA法用于血清登革病毒IgM抗体检测.结果 成功构建重组表达质粒并表达重组蛋白,纯化的重组蛋白用于血清登革病毒IgM抗体检测,以IFTA作为参照标准,灵敏度为93.75％,特异度为91.25％;与Panbio Dengue IgM Capture ELISA试剂盒检测结果相比,二者具有较高的一致性(x2=0.214,P＞0.05;Kappa=0.825).结论 在大肠埃希菌中成功表达登革2型病毒E基因DⅢ区重组蛋白,并能够应用于血清登革病毒IgM抗体检测.
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不同型别登革病毒融合外膜基因重组腺病毒的构建及表达
目的 构建登革病毒1型和2型外膜蛋白(E蛋白)DⅢ区融合基因的重组腺病毒,在BHK-21细胞中表达.方法 用PCR法扩增登革病毒1型和2型EDⅢ基因,依次克隆入pCDNA3.1(+),构建重组质粒pCDNA-D1/D2EDⅢ.以此为模板,扩增包含CMV启动子-D1/D2EDⅢ-BGH pA 的表达片段,与pENTR4载体连接形成质粒pENTR4-D1/D2EDⅢ,与pAd/PL-DEST进行体外同源重组,形成重组腺病毒载体pAd-D1/D2EDⅢ,在293A细胞系中包装成具有感染性的重组腺病毒,进一步感染BHK-21细胞,用间接免疫荧光法和Western blot法检测重组蛋白在细胞中的表达情况.结果 重组腺病毒构建成功,转染293A细胞后获得2×109pfu/mL滴度的重组腺病毒,感染哺乳动物细胞后能够表达1型和2型EDⅢ区目的 蛋白.结论 不同型别融合基因的重组腺病毒表达载体能有效地表达相应型别的目的 蛋白,为进一步构建单一的四价重组腺病毒应用于登革疫苗研究奠定基础.
