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携带TRAIL基因慢病毒载体的构建及其体外感染淋巴瘤细胞效率
本研究目的构建携带人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因的慢病毒载体,并研究其对不同细胞系的淋巴瘤细胞的感染效率.采用分子克隆技术,将针对TRAIL基因mRNA的cDNA片段插入到克隆栽体pGM-T,构建pGM-T-TRAIL,然后将测序正确的TRAIL基因克隆至慢病毒表达载体pWPI,构建慢病毒表达载体pWPI-TRAIL.后利用pWPI/VSV-G/△8.2慢病毒包装系统,通过转染293T细胞,制备重组慢病毒plenti-TRAIL,并进行浓缩和滴度测定.将重组慢病毒栽体感染不同来源的淋巴瘤细胞系,测定荧光表达评价感染效率,利用RT-PCR和Western blot法评价TRAIL基因的表达情况.结果表明,酶切鉴定及测序结果表明pGM -T-TRAIL和pWPI-TRAIL载体构建成功,滴度测定结果显示浓缩的重组慢病毒plenti-TRAIL浓度可达109 IU/ml.感染效率结果显示YTS细胞较DOHH2和Jurkat细胞更易被慢病毒感染(P＜0.05).RT-PCR和Western blot实验表明淋巴瘤细胞后plenti-TRAIL感染后可有效地表达TRAIL基因.结论:成功构建了慢病毒表达载体pWPI-TRAIL,并制备出重组慢病毒plenti-TRAIL.plenti-TRAIL可以有效感染不同细胞来源的淋巴瘤细胞系,同时感染后的淋巴瘤细胞可以有效表达TRAIL基因.
关键词： 人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 慢病毒载体 淋巴瘤 -
辐射诱导表达载体pEgr-hTRAIL的构建及其对肿瘤细胞的体外诱导凋亡作用
目的:构建携带人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(hTRAIL)基因的辐射诱导表达载体pEgr-hTRAIL,并研究其在人肺腺癌细胞株A549中的表达及促凋亡作用.方法:采用常规分子生物学方法构建表达质粒pEgr-hTRAIL,体外通过脂质体转染A549细胞,经G418筛选稳定转染细胞A549-shTRAIL,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测目的基因的表达,采用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒检测细胞早期凋亡.结果:经限制性内切酶酶切鉴定pEgr-hTRAIL表达质粒构建正确;稳定转染细胞A549-shTRAIL的hTRAILmRNA表达量明显增加;稳定转染细胞A549-shTRAIL的凋亡细胞百分数明显增加,是A549细胞的1.8倍(P＜0.05).结论:成功构建pEgr-hTRAIL表达质粒,体外稳定转染细胞A549-shTRAIL具有明显诱导凋亡作用.
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TRAIL及其受体DcR1和DR4在宫颈癌组织中的表达及意义
目的 检测宫颈癌和正常宫颈组织中人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)及其受体DcR1和DR4的表达,探讨TRAIL及其受体的表达与宫颈癌发生、发展的关系.方法 免疫组织化学Envision法检测43例宫颈癌和30例正常宫颈组织中TRAIL及其受体DcR1、DR4的表达.结果 TRAIL、DcR1、DR4免疫阳性产物为棕黄色,定位于胞浆或胞膜,TRAIL及DcR1在宫颈癌组织中的表达显著低于正常宫颈组织,DR4在宫颈癌组织中的表达显著高于正常宫颈组织(P＜0.05);TRAIL、DcR1、DR4在宫颈癌组织中的表达与患者的年龄、分期、淋巴结转移无关(P＞0.05).结论 TRAIL是肿瘤细胞分化差的标志之一;宫颈癌细胞由于DR4的高表达和DcR1的低表达而易被TRAIL诱导凋亡.
关键词： 宫颈肿瘤 人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 死亡受体4 诱骗受体1
