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抑制和激活Wnt信号通路对甾醇类新药NSC67657诱导HL-60细胞单核系分化的影响
目的:探讨抑制和激活Wnt信号通路在甾醇类新药NSC67657诱导HL-60细胞单核系分化中的作用和可能机制.方法:用5、10和20 μmol/L的Wnt信号通路抑制剂XAV-939作用于HL-60细胞3d,用10、20和30mmol/L的Wnt信号通路激活剂LiC1作用于HL-60细胞1d,应用RT-RCR和Western blot检测Wnt信号通路的下游靶点基因和蛋白表达水平,流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD14的表达和细胞早期凋亡,筛选佳抑制浓度和激活浓度.然后用10 μmol/L NSC67657分别对已经抑制及激活了的Wnt通路的HL-60细胞作用3d.分析比较空白对照组、NSC67657单独处理组和激活/抑制剂作用后NSC67657处理组的细胞表面抗原CD14和Wnt下游靶点蛋白的表达水平.结果:20 μmol/L XAV-939和20 mmol/L LiC1能分别有效抑制和激活HL-60细胞Wnt信号通路,分别显著下调和上调cyclinD1,TCF1,c-Jun基因(P＜0.05)和蛋白(P＜0.05)的表达,且在该条件下CD14+ HL-60细胞不超过1％,没有早期凋亡发生;NSC67657单独作用HL-60细胞能下调Wnt通路下游靶点cy-clinD1 、TCF1和c-Jun的蛋白表达(P＜0.05),CD14+细胞占(62.13±9.44)％;NSC67657作用于经XAV-939预处理的细胞,可使CD14+细胞达到(84.17±5.39)％,cyclinD1,TCF1和c-Jun蛋白表达比单独NSC67657处理组降低更显著(P＜0.01);而NSC67657作用经LiC1预处理的细胞,可使CD14+细胞减少至(33.99±8.37)％,cy-clinD1,TCF1和c-Jun蛋白表达较非处理组下降明显较低(P＜0.05),但高于单独使用NSC67657处理组(P＜0.05).结论:20 μmol/L XAV-939和20 mmol/L LiC1作为HL-60细胞Wnt信号通路的有效抑制剂和激活剂能够分别显著下调和上调Wnt下游通路靶点基因和蛋白表达,其干预后对NSC67657诱导细胞分化的影响提示Wnt信号通路可能在NSC67657诱导HL-60细胞单核系分化中起到关键作用.
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CCAAT增强子结合蛋白α在甾醇类新药NSC67657诱导HL60细胞向单核系分化中的作用
目的 探讨CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)在甾醇类新药NSC67657诱导HL60细胞向单核系分化中的作用.方法 采用NSC67657诱导HL60细胞分化,流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD14的表达.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法连续检测C/EBPα基因和蛋白在细胞分化前后的表达情况.构建pDsRed-C/EBPα真核表达载体,基因测序后采用电转染技术,将真核表达载体转入HL60细胞中,并进行表达验证.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、瑞氏染色和流式细胞技术,观察转染细胞在NSC67657作用前后的增殖和分化情况.结果 10 μmol/L NSC67657可以诱导HL60细胞向单核系分化,连续诱导5 d后,有93.9%的细胞有CD14阳性表达.分化后的HL60细胞中,C/EBPα基因和蛋白表达均先升高后下降,分别在第2天和第3天达到峰值.真核表达载体构建成功,通过电转染和G418筛选,可获得90%以上阳性克隆.C/EBPα高表达可使HL60细胞增殖明显减缓,表面抗原CD11b的表达可达到(50.44±4.92)%.在NSC67657处理的重组质粒转染HL60细胞中,细胞单核系分化受到抑制,保留部分粒系分化.结论 NSC67657诱导HL60细胞向单核系分化不一定通过C/EBPα蛋白的协调作用,但C/EBPα蛋白高表达可以阻止NSC67657诱导HL60细胞向单核系分化的进程.
关键词： CCAAT增强子结合蛋白α NSC67657 HL60细胞 单核系分化
