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应用SOE PCR方法构建新城疫病毒基因起始片段的研究
目的 以猪源新城疫病毒JL02/2000株为模板,构建新城疫病毒反向遗传研究所需的基因起始片段. 方法 将NDV起始片段(ND1,226-4 916 bp)设计拆分为ND1-1、ND1-2、ND1-3、ND1-4的4个约1.2kb的小片段,分别PCR扩增各片段,后采用SOE PCR技术将ND1-1、ND1-2拼接成中间片段ND1-1-2,将ND1-3、ND1-4拼接为ND1-3-4,再经第二次SOE-PCR整合拼接ND1-1-2和ND1-3-4片段,完成NDV起始片段ND1的构建,并连接到pCI载体上,构建pCI-ND1质粒,后经酶切PCI-ND1质粒并送测序鉴定目的片段是否构建正确并成功连接到pCI载体上. 结果 经PCR扩增得到ND1-1、ND1-2、ND1-3、ND1-4共4个分别约1 200 bp大小的片段,经第一轮SOE-PCR得到ND1-1-2和ND1-3-4两个2 200 bp左右的片段,第二轮SOE-PCR得到4 900 bp左右的ND1片段.连接产物PCI-ND1质粒经酶切和测序鉴定片段大小和序列与预期相符. 结论 成功构建了新城疫病毒基因起始片段(226-4 916 bp),为构建新城疫病毒全长基因奠定了基础.
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VEGF189基因合成、原核表达及鉴定
目的 获得编码VEGF189蛋白的基因,并通过原核表达系统表达VEGF189融合蛋白.方法 应用SOE PCR技术合成VEGF189基因,克隆入pET-32a(+)原核表达载体,转化E coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经HisTrapTM HP亲和柱层析纯化,测定蛋白浓度.结果 DNA测序分析表明,合成的VEGF189基因与文献报道相一致.在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的Trx-VEGF189融合蛋白,以包涵体和可溶2种形式存在.表达产物可被兔抗鼠VEGF多抗特异识别.经HisTrapTM HP亲和柱纯化,获得纯度达85%的融合蛋白.结论 成功合成VEGF189基因,并在原核表达系统中获得高表达,为研制高效抗肿瘤的VEGF抗体和疫苗奠定了前期基础.
