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阴道毛滴虫RRas基因序列的cDNA一步克隆、表达及鉴定
目的 一步克隆、表达及鉴定阴道毛滴虫RRas基因,以了解其在组织细胞定位和功能. 方法 用PCR方法从阴道毛滴虫cDNA文库中扩增RRas片段,用一步克隆法构建RRas-PQE-80L载体,进行菌落PCR和酶切鉴定,阳性克隆提取质粒,经测序鉴定后转化至大肠埃希菌(E.coli) BL21,经异丙硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导.表达产物用Ni-Agarose His纯化试剂盒纯化,纯化产物经SDS-PAGE电泳鉴定和Western blot分析. 结果 从阴道毛滴虫cDNA表达文库中扩增的RRas基因片段长617 bp,酶切及DNA测序证实RRas-PQE-80L重组质粒构建正确.表达的融合蛋白分子质量单位约为23.6 ku,该蛋白能被抗His标签抗体识别. 结论 成功构建重组原核表达质粒RRas-PQE-80L载体,并能在E.coli BL21中表达,表达蛋白具有反应原性.
关键词： 阴道毛滴虫 RRas基因 一步克隆 原核表达 Western blot -
阴道毛滴虫RRas基因的cDNA克隆和原核表达
目的 克隆和表达阴道毛滴虫Rras(TvRRas)基因,以便进一步探讨其组织定位及功能.方法 应用PCR方法从构建的阴道毛滴虫cDNA表达文库中扩增TvRRas基因片段,克隆至pGEM-T载体,经PCR、酶切和测序鉴定后亚克隆至原核表达载体pET-41a,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍-硝基三乙酸(Ni-NTA)柱纯化表达产物后用SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析鉴定.结果 从阴道毛滴虫cDNA表达文库中扩增的TvRRas基因片段长522 bp,酶切及DNA测序证实pET-41a/TvRRas重组质粒构建正确,表达融合蛋白分子量约为45 000 u.结论 成功构建重组原核表达质粒pET-41a/TvRRas,并能在大肠埃希菌内表达,所表达的融合蛋白分子量大小与预期一致.
