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弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体构建及在Vero细胞中的表达
目的构建弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体,并在Vero细胞中表达. 方法设计1对引物,从弓形虫RH株速殖子基因组DNA中扩增SAG2全长编码基因,构建pVAX1-SAG2真核表达重组质粒.以限制性内切酶KpnⅠ和 EcoRⅠ进行双酶切、PCR鉴定,纯化后进行测序鉴定.脂质体介导法瞬时转染Vero细胞,同时以pVAX1为对照,48 h后收集细胞, Western-blot鉴定. 结果从弓形虫RH株DNA中扩增出了577 bp的SAG2基因,构建了真核表达载体pVAX1-SAG2,在质脂体介导下转染Vero细胞,质粒DNA成功的转染到细胞中.通过Westen-blot分析,细胞裂解液样品有1条可被弓形虫免疫血清所识别的约17 ku大小的条带,与预计大小一致. 结论真核表达载体pVAX1-SAG2在Vero细胞中有一定表达,且有一定的活性.
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弓形虫SAG2基因在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究
目的 在毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中表达弓形虫SAG2基因,探索一种新的有效活化机体抗弓形虫免疫反应的疫苗.方法 以重组质粒pET23a-SAG2为模板,亚克隆目的 片段SAG2至酵母菌分泌表达载体pPICZαA,重组质粒经线性化后电转化转染至毕赤酵母菌GS115菌株,经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子.经甲醇诱导表达,取细胞裂解上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)分析.以整体重组酵母菌作为疫苗腹腔免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的免疫反应. 结果 成功构建了pPICZαA-SAG2毕赤酵母表达重组质粒.经甲醇诱导,在酵母细胞内表达分子质量单位为22 ku的蛋白.Western blot显示,22 ku蛋白可被抗-His标签抗体识别. 结论 在毕赤酵母菌中成功表达了SAG2基因.整体重组酵母活菌具有免疫原性.
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弓形虫SAG1-SAG2复合DNA疫苗免疫小鼠诱导的免疫保护性
目的利用已构建的弓形虫主要表面抗原SAG1 DNA疫苗及SAG1-SAG2复合DNA疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性.方法将两核酸疫苗分别通过肌肉注射免疫小鼠,对照组注射pcDNA3.1空质粒.ELISA法检测血清IgG抗体及细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-4;用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定免疫鼠脾脏NK细胞杀伤率;流式细胞仪测定T细胞亚群;用弓形虫速殖子腹腔攻击感染小鼠,观察小鼠的生存时间.结果SAG1-SAG2组小鼠IgG抗体、IFN-γ、IL-2及CD4+/CD8+细胞比例均高于SAG1组(P＜0.05);各组均未检测到IL-4;复合DNA疫苗组感染弓形虫后生存时间较单基因组延长(P＜0.01).结论弓形虫SAG1-SAG2复合DNA疫苗较SAG1单基因疫苗具有更好的免疫保护性.
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弓形虫SAG2基因体外扩增、克隆及在耻垢分支杆菌中的表达
目的 体外扩增弓形虫RH株表面抗原2(SAG2)基因,并构建大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒ps3000-SAG2,构建重组耻垢分支杆菌,免疫接种小鼠,通过检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体,证明SAG2重组蛋白在耻垢分支杆菌中有表达.方法 采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增弓形虫RH株的SAG2基因,克隆入pGEMT载体,然后构建亚克隆ps3000-SAG2大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒,经电转化方法,将SAG2基因的穿梭质粒转化到耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis mc2155)中,用重组耻垢分支杆菌免疫小鼠,Western-blotting方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体.结果 成功扩增了弓形虫的SAG2基因;正确构建穿梭质粒ps3000-SAG2,免疫印迹分析,免疫小鼠血清能所识别SAG2重组蛋白.结论 耻垢分支杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白SAG2,具有抗原性,刺激小鼠机体产生出了抗弓形虫的抗体,为下一步弓形虫重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础.
