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巴西利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的克隆化与序列分析
根据硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因序列,设计并合成无鞭毛体蛋白基因特异性引物,以巴西利什曼原虫基因组为模板,进行多聚酶链反应(PCR)技术扩增,获得550bp的基因片段,经测序证实,巴西利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因含有唯一的开放读码框架(ORF),为552nt,编码的无鞭毛体蛋白由183个氨基酸残基(aa)组成.与硕大利什曼原虫及亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白一级结构的同源性分别为100%和93.44%.
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杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒的免疫原性研究
目的 研究杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒pcDNA3.1-amastin的免疫原性.方法 将18只雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,每组9只.两组分别肌肉注射重组质粒pcDNA3.1-amastin和空质粒pcDNA3.1(+) (50 μg/只),2周后同法加强免疫1次.加强免疫后第7、14和21天每组各取小鼠3只,内眦采血,分离血清,间接ELISA法测定血清中抗原特异性抗体水平.随后脱颈处死小鼠,无菌取脾,分离脾细胞,用刀豆球蛋白A刺激培养,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测脾淋巴细胞增殖活性和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性.双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和IL-4的水平.结果 加强免疫后第7、14和21天,实验组均检测到特异性IgG抗体,效价在1:640以上,而对照组未检测到IgG抗体(P＜0.01);实验组脾淋巴细胞增殖活性刺激指数分别为4.28±0.51、5.01±0.60和4.39±0.50,均高于对照组(P＜0.01);实验组脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ含量分别为(42.06±4.26)、(66.02±6.02)和(58.29±3.75) pg/ml,IL-2含量分别为(38.21±5.11)、(64.79±8.67)和(52.69±7.15) pg/ml,均高于对照组(P＜0.01),两组均未检测到IL-4;实验组脾淋巴细胞CTL杀伤活性分别为(42.20±5.96)%、(63.66±5.44)%和(52.24±4.56)%,均高于对照组(P＜0.01).结论 杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒pcDNA3.1-amastin免疫小鼠后可诱导其产生特异的体液免疫应答和Th1型细胞免疫应答.
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杜氏利什曼原虫四川分离株无鞭毛体蛋白基因的克隆及真核表达
目的 克隆、真核表达杜氏利什曼原虫四川株的无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因.方法 PCR扩增杜氏利什曼原虫四川汶川人株L.d.SC10H2与四川南坪犬株L.d.SC7的无鞭毛体蛋白基因,将该基因导入poDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒,转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法鉴定重组质粒的瞬时表达;RT-PCR和Western blotting鉴定稳定表达.结果 2株杜氏利什曼原虫均扩增出552 bp的无鞭毛体蛋白基因,同源性为86%.转染后在NIH3T3细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞中获得短暂表达.细胞裂解产物经Westernblotting,在相对分子质量(Mr)约20000处检测到阳性杂交信号,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞内获得了稳定表达.结论 获得了我国杜氏利什曼原虫四川分离株L.d.SC10H2和L.d.SC7的无鞭毛体蛋白基因序列,并在NIH3T3细胞中稳定表达.
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利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因克隆化与序列分析
目的克隆4株利什曼原虫表面无鞭毛体蛋白(amastin)的编码基因，并进行序列分析。方法根据锥虫(T. cruzi)与利什曼原虫亲缘关系相近的原则，首先以锥虫无鞭毛体蛋白的基因为参考，对GenBank中的dbEST数据库检索，获得硕大利什曼原虫(L.major)一段309核苷酸片段，根据其序列合成探针，对硕大利什曼原虫基因组DNA文库筛选，首先获得硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因，再以硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因序列为依据，合成特异性引物，以多聚酶链反应(PCR)扩增获得亚马逊利什曼原虫(L.ama.)、巴西利什曼原虫(L.bra.)和墨西哥利什曼原虫(L mtx.)的无鞭毛体蛋白基因。结果克降了4株利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码的基因。均为国际上首次克隆化基因，已被美国GenBank收录。结论实现了4株利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因的克隆化。
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墨西哥利什曼原虫无鞭毛体蛋囟的基因克隆化与序列分析
目的 克隆墨西哥利什曼原虫(L.mer)WR972株的无鞭毛体蛋白(amastin)的编码基因，并对其同源核苷酸序列进行分析。方法 根据已克隆的亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因序列，设计并合成无鞭毛体蛋白基因特异性引物，以墨西哥利什曼原虫VR972株的基因组DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增。将扩增的DNA片段克隆到pCR2.1 T载体中，进行测序，并对同源的核苷酸序列分析、比较。结果 从体外培养的墨西哥利什曼原虫WR972株提取基因组DNA，以无鞭毛体蛋白基因特异性引物进行PCR扩增获得550bp的DNA片段。克隆到pCR2.1 T载体片段进行的序列测定结果 表明，获得了墨西哥利什曼原虫的无鞭毛体蛋白编码基因片段，与亚马逊利什曼原虫的无鞭毛体蛋白基因之间具有高度的同源性。结论 实现了墨西哥利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的克隆化，为进一步研究其表达及作为疫苗研究的候选基因奠定了基础。
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杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因原核表达重组质粒的构建
目的:构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因的原核表达重组质粒pET-amastin.方法:提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pET-32a(+),构建原核表达重组质粒pET-amastin.结果:扩增出大小约550 bp的无鞭毛体蛋白基因,重组质粒pETamastin经鉴定正确.结论:成功构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因原核表达重组质粒pET-amastin.
