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家蝇源抗K562活性物质的分离与纯化
为从家蝇Ⅲ龄幼虫体内提取具有抗K562细胞活性的物质,并对其组分化学性质及对人正常细胞的作用进行分析.本文用大肠杆菌诱导家蝇Ⅲ龄幼虫大量表达活性物质,然后通过研磨、离心、固相萃取法(SPE)初步分离活性物质,通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进一步纯化提取活性组分,通过四甲基偶氮噻唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法和光镜观察法相结合,筛选出对K562有抑制作用的活性组分,并鉴定其对人正常细胞293T的作用.结果显示,从家蝇Ⅲ龄幼虫体内分离出4个具有抑制K562细胞活性的多肽组分(峰5～8),具有分离度高、纯度高等特点.当质量浓度为100 μg/mL和作用时间为24 h时,4个多肽组分均具有抗K562细胞的活性,其中峰5多肽组分和峰8多肽组分活性较强,对K562细胞的相对抑制率分别为48.52%和65.80%.结果表明,家蝇Ⅲ龄幼虫体内存在一些具有抗K562细胞活性的多肽,而且对人正常细胞几乎无杀伤作用.但是,这些多肽是否属于抗肿瘤肽还有待被证实.
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ADAM9基因真核表达质粒的构建及表达
目的:构建人源性去整合素金属蛋白酶9(ADAM9)基因真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞).方法:利用包含ADAM9全长编码核酸序列的质粒PCR4-TOPO作为模板,用PCR扩增其核心编码区,将其克隆至PMD18-T Vector中构建PMD18-T-ADAM9质粒,同时双酶切PMD18-T-ADAM9及PXJ40-HA后构建PXJ40-HA-ADAM9真核表达载体,经酶切鉴定及测序后将载体转染至293T细胞中,通过免疫印记法检测ADAM9蛋白的表达.结果:经过双酶切和测序结果鉴定PXJ40-HA-ADAM9载体构建成功,经过Western blot法证实ADAM9基因表达.结论:成功克隆ADAM9基因并构建其真核表达载体,该载体的构建为后期建立稳定表达ADAM9细胞模型,并稳定表达ADAM9蛋白,为进行ADAM9功能研究提供可能.
关键词： 去整合素金属蛋白酶9 真核表达载体 293T 免疫印记 -
介孔二氧化硅纳米材料分散性对293T细胞凋亡的影响
目的 介孔二氧化硅纳米材料(mesoporous silica nanomaterials,MSNs)的理化性质如分散性会影响细胞摄取率,可能造成细胞凋亡.文中采用体外培养方法观察2种分散性不同的MSNs对293T细胞凋亡的影响. 方法 制备2种分散性不同的纳米材料MSN-1和MSN-2;透射电镜观察293T细胞对2种材料的吞噬;选择0、100、150、200和250 μg/mL共5种浓度与293T细胞体外孵育24h,流式细胞仪检测细胞凋亡反应. 结果 与MSN-1比较,MSN-2的分散性较好;293T细胞约吞噬10％的MSNs;与0μg/mL比较,100、150、200、250 μg/mL的MSN-1与293T细胞共孵育引起细胞凋亡反应明显(P＜0.05),而MSN-2并未引起明显的凋亡反应. 结论 在一定剂量下,分散性较佳的MSN-2在293T细胞内性能稳定,安全性较高.
关键词： 介孔二氧化硅纳米材料 分散性 293T 吞噬 细胞凋亡 -
miR-93真核表达载体的构建及其表达验证
目的 构建人miR-93真核表达载体,并验证其表达效果,为进一步研究miR-93的生物学功能提供有利工具.方法 用PCR方法从293T细胞基因组DNA中扩增miR-93前体序列,引物引入酶切位点和保护碱基,产物用限制性内切酶EcoR Ⅰ和BglⅡ双酶切后插入pEZX-MR04表达载体中,构建miR-93真核表达载体pEZX-MR04-miR-93.构建好的载体用双酶切、PCR和测序鉴定,同时转染293T细胞,用Real time PCR检测重组pEZX-MR04-miR-93质粒的miR-93表达效率.结果 成功构建miR-93真核表达载体pEZX-MR04-miR-93,重组pEZX-MR04-miR-93质粒转染293T细胞后miR-93表达上升约21倍.结论 构建的miR-93真核表达载体pEZX-MR04-miR-93可显著上调细胞中miR-93水平,为进一步研究miR-93在泌尿系肿瘤中的生物学功能提供可靠工具,奠定了坚实的实验基础.
