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人参铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及纯化
研究提取人参叶中的总RNA,采用RT-PCR扩增人参叶Cu/Zn-SOD基因,构建pET-28 (a)-Cu/Zn-SOD原核表达载体.使用Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达.利用镍离子亲和层析进行纯化,并采用黄嘌呤氧化酶法测定目的蛋白的酶活.经RT-PCR扩增的人参Cu/Zn-SOD基因序列与GenBank数据库中公布的高丽参Cu/Zn-SOD基因序列同源性为99.00％.经IPTG诱导,目的蛋白的表达量约为44.42％,相对分子质量为16.30 kDa.纯化后的蛋白酶活可达到10 596.69 U·mg-1.通过分子生物学方法,成功构建了人参pET-28(a)-Cu/Zn-SOD原核表达载体,为进一步研究人参Cu/Zn-SOD生物学功能奠定了基础.
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棉铃虫核型多角体病毒sod基因在大肠杆菌中的表达
用PCR方法从棉铃虫(Helicoverpa armigera)单粒包埋型核型多角体病毒(HaSNPV) C1株基因组中扩增sod基因编码区,克隆到pGEM-T-easy vector,测定了核苷酸序列.将基因编码区克隆到原核表达载体pETblue2,构建了含表达质粒pETblue2/HaSNPV SOD,转化大肠杆菌DE3(BL21)进行IPTG诱导表达. SDS-PAGE分析表明SOD的表达量约为细胞总蛋白的37%.邻苯三酚法测定表达蛋白活性,结果表明每毫克菌体可溶性总蛋白中表达产物校正酶活力单位为694U/mg.
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黄芪多糖对过氧化氢诱导的内皮细胞损伤的保护作用
目的:观察黄芪多糖(Astragalus polysaccharide,APS)对过氧化氢(H2O2)诱导的人脐静脉内皮细胞HUVECs损伤的保护作用及其可能的作用机制.方法:不同浓度的黄芪多糖孵育内皮细胞1h后加入400μmol/L的H2O2继续培养24h,用MTT法检测细胞活性;DAPI/PI双染法观察细胞形态并统计细胞凋亡率;硝酸还原酶法测定NO释放量;Western blot法测定Cu/Zn-SOD蛋白表达.结果:H2O2模型组细胞活性较之空白对照组下降42.87％,细胞核皱缩形态不规则化,细胞凋亡率升高了7倍、NO释放量降低42.96％ ,Cu/Zn-SOD蛋白表达下降45.31％;与模型组相比黄芪多糖各剂量组可不同程度改善这些变化,其中黄芪多糖1μg/ml组作用为明显,其细胞活性和NO释放量分别增加24.96％、32.13％,细胞凋亡率降低36.02％,Cu/Zn-SOD蛋白表达升高37.14％.结论:黄芪多糖可能通过影响内皮细胞NO释放量和Cu/Zn-SOD蛋白表达,改善细胞NO与氧自由基的平衡发挥保护作用.
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高原花斑裸鲤Cu/Zn-SOD的克隆鉴定表达及其对Cu2+胁迫的应答
目的 对高原花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)铜锌-过氧化物岐化酶(Cu/Zn-Superoxide Dismutase,Cu/Zn-SOD)基因的克隆鉴定表达及对其Cu2+胁迫的应答分析.方法 采用RT-PCR和RACE技术获得G.eckloni Cu/ Zn-SOD全长cDNA序列,分析生物信息学特征和在不同组织的表达分布.在Cu2+的胁迫下,通过实时定量PCR检测花斑裸鲤肝、肾、脑、鳃组织中Cu/Zn-SOD的表达变化,探究其是否能够作为响应重金属污染胁迫的一种生物标记物.结果 Cu/ Zn-SOD的cDNA序列全长785 bp,其中3'-UTR为277 bp,5'-UTR为43 bp,编码区为465 bp,可编码154个氨基酸(GenBank登录号为:KX826080).在Cu2+胁迫下,花斑裸鲤肝、肾、脑、鳃组织中的GeCu/ Zn-SOD在mRNA水平相对表达量呈现出一定的规律性.结论 成功实现高原花斑裸鲤Cu/Zn-SOD的克隆鉴定表达,初步得到了花斑裸鲤Cu/Zn-SOD对Cu2+胁迫的应答模式.
