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ELISA法测定大鼠血清中聚乙二醇化重组蛋白(PEG-SOP55)浓度及代动力学研究
目的:建立一种检测大鼠血清中聚乙二醇化重组蛋白(PEG-SOP55)浓度的ELISA方法,并进行该蛋白的药代动力学初步研究.方法:以该蛋白的多抗包被,标记生物素的单抗检测,生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶两级酶联放大检测信号,构建双抗夹心ELISA法进行浓度检测.通过对包被抗体和检测抗体工作浓度的优化实验,血清基质的干扰实验,不同结构聚乙二醇分子的比较实验,建立该方法的基本实验条件.并参考相关法规,对其方法特异性、准确度、精密度、耐用性、检测限度以及样品稳定性进行验证.分别用PEG-SOP5530 kDa、PEG-SOP5540 kDa、PEG-SOP5540 kDa branched进行Lewis大鼠腹腔单次给药然后测定血清浓度,获得该蛋白用不同分子结构聚乙二醇分子修饰后的药代动力学参数.结果:实验证实聚乙二醇修饰降低了检测抗体和目标分子的结合效率,且大鼠血清和聚乙二醇分子结构变化对检测有干扰.通过提高包被抗体浓度,获得对目标分子较好的捕获效率.通过将血清样品稀释液从PBS替换为咪唑缓冲液,且保持标准曲线和待测样品血清稀释倍数一致,克服了血清基质所带来的干扰.通过保持标准曲线和待测样品聚乙二醇分子结构一致,克服了因聚乙二醇分子结构不同带来的干扰.方法验证结果表明该方法特异性良好,回收率为(1OO±15.2)％,实验内精密度和实验间精密度验证数据RSD均不超过20％,不同操作人员对检测结果无显著影响,标准曲线线性良好,标准曲线的高和低浓度能够准确测定.将大鼠血清样品反复冻融3次,在室温放置4h其稳定性均符合要求,满足该方法检测条件.通过对Lewis大鼠血清样品进行浓度测定,获得PEG-SOP5530kDa、PEG-SOP5540 kDa、PEG-SOP5540 kDa branched的药代动力学参数.其Cmax分别为31.9、54.4、67.7 mg·mL-1,AUC0-∞分别为823.0、1 978.0、3 502.6 mg·h·mL-1,t1/2分别为15.6、22.3、30.6h.结论:成功建立检测PEG-SOP55在大鼠血清中浓度的ELISA方法.通过方法验证表明:该方法专属性、准确度、精密度、线性以及耐用性良好,测定范围为5～80 ng· mL-1.大鼠血清样品稳定性满足该方法检测要求,该方法可作为PEG-SOP55药代动力学研究的检测方法,也为类似制品的血清浓度检测提供借鉴.初步药代动力学研究表明,随着聚乙二醇分子对蛋白的屏蔽作用增强,能够显著延长其半衰期,提高药物在体内的暴露量.
