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金属亲和层析文献资料
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人睾丸精子结合蛋白-His6融合蛋白在真核细胞中的表达及亲和纯化
目的:构建含有人睾丸精子结合蛋白基因(testis sperm binding protein,tsbp)的真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)B/tsbp,并进行表达和纯化.方法:以克隆有tsbp全长cDNA序列的原核表达载体pGEX-5X-1/tsbp为模板,用PCR扩增tsbp,并通过DNA重组构建真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)B/tsbp.以重组体稳定转染HEK293细胞后,应用RT-PCR、 Western blot和细胞免疫荧光技术检测His6-tsbp融合蛋白的表达.选择高表达量的细胞克隆,扩增并用Ni2+-NTA金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6-tsbp,纯化产物的纯度用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果:成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)B/tsbp.以重组体转染HEK293细胞后,用RT-PCR检测到tsbp mRNA的表达.细胞免疫荧光染色呈阳性反应,Western blot检测到培养细胞中有融合蛋白His6-tsbp的表达.经Ni2+-NTA金属亲和层析柱分离纯化,得到纯化的重组蛋白His6-tsbp.结论:构建了pcDNA3.1/myc-His(-)B/tsbp真核表达载体,并在HEK293细胞中表达和亲和层析纯化,为下一步的研究奠定了基础.
