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短发卡RNA(shRNA)文献资料
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稳定敲低Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)的BV2细胞系建立
目的 构建Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)基因的短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体,并建立稳定敲低PPM1A表达的BV2小鼠脑小胶质细胞系.方法 针对PPM1A基因的编码序列(CDS)区,设计合成2对短发卡RNA(shRNA)序列shRNA1、shRNA2,分别将其克隆到GV493载体中,并转化至感受态大肠杆菌DH5α菌株,培养后挑取阳性克隆子进行测序,后包装慢病毒并进行滴度测定.将2组慢病毒分别转染BV2小鼠脑小胶质细胞,并给予嘌呤霉素筛选,使用荧光显微镜及流式细胞术观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,评估转染结果,分别采用实时定量PCR和Western blot法检测PPM1A的mRNA和蛋白水平.结果 PPM1A基因shRNA慢病毒表达载体经过测序鉴定构建成功,转染BV2小鼠脑小胶质细胞后GFP表达率大于80％;与对照组相比,shRNA1及shRNA2敲低组PPM1A mRNA及蛋白水平均显著降低.结论 利用慢病毒shRNA方法成功构建PPM1A敲低的BV2细胞系.
