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四十年抗菌肽研究史—华西人的理解和历程
本文着重以防御素为代表,回顾了人源性抗菌肽的研发历程和取得的一些重要学术成果;就研发过程中所发生的一些插曲进行了评述;也对本实验室有关核因子和抗菌肽分子HMGN2的研究进展做了简述.
关键词： 抗菌肽 高迁移率非组蛋白N2 历史 -
HMGN2在牙周炎菌斑生物膜形成中的作用
目的 研究牙周炎患者唾液高迁移率非组蛋白N2 (HMGN2)含量与牙周炎相关性以及其在牙菌斑生物膜形成中的作用.方法 纳入100例参与者,分为健康组、轻度牙周炎组、中度牙周炎组和重度牙周炎组,每组25例,采用酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测各组唾液中HMGN2的质量浓度.重组人HMGN2蛋白提纯和鉴定后,K-B法检测重组人HMGN2对牙周炎主要致病菌牙龈卟啉单胞菌的抑菌作用,结晶紫染色法检测重组人HMGN2对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的影响.结果 与健康组相比,牙周炎患者(尤其是重度牙周炎患者)唾液中HMGN2升高(P＜0.01),HMGN2质量浓度与患者牙菌斑指数呈负相关(r=一0.363,P＜0.05).重组人HMGN2能有效抑制牙周致病菌生长和菌斑生物膜形成(P＜0.05).结论 HMGN2参与了牙周炎菌斑生物膜的形成,在牙周炎发病过程中发挥重要作用.
关键词： 牙周炎 高迁移率非组蛋白N2 唾液 牙龈卟啉单胞菌 -
重组人HMGN2在大肠杆菌中表达及其体外抗乙型肝炎病毒活性研究
目的 制备重组人高迁移率非组蛋白N2蛋白(HMGN2),研究重组HMGN2的抗乙型肝炎病毒(HBV)活性.方法 通过RT-PCR分离纯化人HMGN2基因,并将其构建到原核表达质粒pGEX-4T-1中,经IPTG诱导表达.产物经GST蛋白纯化系统进行纯化,用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定.采用MTT法检测重组HMGN2蛋白对稳定转染复制型HBV重组质粒的肝癌细胞株HepG2.2.15细胞的细胞毒性;不同浓度HMGN2蛋白作用于HepG2.2.15细胞,分别在第3 d和6 d收集细胞培养上清液,ELISA检测上清中HBV表面抗原(HBsAg)及e抗原(HBeAg),采用实时荧光定量PCR法检测上清液HBV DNA的含量.结果 成功构建了HMGN2蛋白原核表达载体pGEX-HMGN2,并分离提纯了原核表达的HMGN2蛋白.Western blot结果显示,该蛋白能被抗HMGN2抗体识别.在检测的1～100μg/mL范围内,HMGN2蛋白对HepG2.2.15细胞的无细胞毒性;HMGN2蛋白在1～5μg/mL水平即可抑制HBeAg和HBsAg的表达,可降低HBV DNA拷贝数.结论 成功构建HMGN2原核表达载体,并分离提纯了纯度较高的HMGN2蛋白;重组的HMGN2蛋白在体外具有较强的抗HBV活性.
关键词： 高迁移率非组蛋白N2 原核表达 抗HBV活性 -
重组人HMGN2多克隆抗体的制备及应用
目的制备人高迁移率非组蛋白N2(HMGN2)多克隆抗体,并用于HMGN2的亚细胞定位分析.方法提取人淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)总RNA,应用RT-PCR从其总RNA中分离HMGN2 cDNA,以pGEX-1λT为载体,构建HMGN2基因大肠杆菌表达载体.应用GST亲合层析柱分离GST-HMGN2融合蛋白,将此融合蛋白免疫新西兰兔,获得抗血清经正辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化.用ELISA法检测HMGN2抗体,免疫细胞化学染色法分析HMGN2的亚细胞分布.结果经酶切产物电泳分析和DNA序列测定证明成功构建出HMGN2基因重组原核表达载体pGEX-1λT-HMGN2.转化大肠杆菌经异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获得相对分子质量约35×103的GST-HMGN2融合蛋白.该融合蛋白免疫所得免疫血清经ELISA检测显示获得滴度为1∶2000的较高效价的兔抗人HMGN2多克隆抗体.并应用此抗体对THP-1细胞进行的免疫细胞化学染色显示,经LPS刺激后除细胞核外,胞浆亦明显着色.而且用ELISA法在细胞培养液亦检测到HMGN2.结论本实验成功制备出HMGN2特异多克隆抗体,免疫细胞化学分析初步证明在LPS刺激下HMGN2不仅分布于单核吞噬细胞核,还分布于细胞浆,并可释放到细胞外.
关键词： 高迁移率非组蛋白N2 原核表达 多克隆抗体 单核吞噬细胞 亚细胞定位
