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Oligofectamine介导转录因子SP1诱骗性寡核苷酸转染猪内皮细胞系条件的优化研究
目的 确定SP1诱骗性寡核苷酸(Decoy Oligodeoxynucleotides,ODNs)在Oligofectamine介导下转染猪血管内皮细胞系SV-40-PED的佳转染条件和效果.方法 以SV-40-PED为转染对象,在6孔培养板中,接种SV-40-PED细胞2×105/孔,将4 μl Oligofectamine和不同浓度的SP1 ODNs(2.5、5.0、7.5、10.0和12.5 μl)分别溶于100 μl无血清、无抗生素的DMEM培养基,室温放置20 min后转染细胞,SP1 ODNs终浓度分别为50、100、150、200和250 nmol/L、转染26 h检测不同浓度转染情况,确定佳SP1 ODNs与Oligofectamine的比率、转染时间;流式细胞仪检测细胞内的相对荧光强度及摄取率评价转染效率;荧光显微镜观察细胞内荧光分布;测定细胞上清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)含量,观察细胞损伤情况. 结果 SV-40-PED在Oligofectamine的介导下可以摄取SP1 ODNs.SP1 ODNs终浓度为50、100、150 nmol/L 组细胞形态无明显变化,终浓度为200、250 nmol/L组细胞收缩、变圆后逐渐恢复;SP1 ODNs终浓度为250 nmol/L时, 转染26 h时细胞形态也无明显变化,48、72 h时有细胞漂浮现象.荧光下观察,转染成功各组荧光物质分布于细胞核内,其中SP1 ODNs终浓度为200、250 nmol/L组可见清晰核仁,浓度越高,荧光强度越强,细胞内荧光物质主要聚集于细胞核.SP1 ODNs终浓度为250 nmol/L时,转染72 h组LDH浓度为137.12±3.92 U/L,显著高于26 h的49.61±17.13 U/L和48 h的120.26±8.42 U/L,均有统计学意义(P＜0.01);当转染时间为26 h时,各浓度组上清液LDH值差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 SP1 ODNs终浓度为250 nmol/L、转染26 h时可以为SV-40-PED转染提供良好效果.
关键词： SP1诱骗性寡核苷酸 转录因子 转染 猪内皮细胞系 -
人类白细胞抗原G1转染猪内皮细胞降低异种细胞排斥反应的研究
目的研究转染人类白细胞抗原G1(human leukocyte antigen G1,HLA-G1)基因后的猪内皮细胞系(porcine endothelial cells,PECs)细胞,对人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和自然杀伤细胞92(nature killer cell 92,NK-92)细胞介导的杀伤作用的改变. 方法利用脂质体包裹的方法,将携带HLA-G1基因的真核表达载体pcDNA3.0转染PECs细胞,在蛋白质水平通过间接免疫荧光法、在RNA水平通过RT-PCR,检测HLA-G1的表达;取6名健康志愿者,每人5 ml静脉血,分离出单个核细胞和NK-92作为效应细胞,利用51Cr释放试验来检测其杀伤作用的改变. 结果转染HLA-G1基因后,在转染的内皮细胞中蛋白质水平和RNA水平均检测到HLA-G1基因的表达;PBMC和NK-92细胞介导的对PECs细胞的杀伤作用均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05). 结论转染HLA-G1后的PECs,可有效地降低由人NK细胞介导的杀伤作用,从而为抑制异种细胞排斥反应提供了新的思路.
