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生物反应器中不同载荷培养促进传代软骨细胞的软骨生成效应
目的 探讨第3代软骨细胞在生物反应器中经载荷培养的软骨生成效应,为自体软骨移植临床应用提供实验依据. 方法 取3～4月龄西门塔尔小牛新鲜膝关节软骨,采用酶消化法分离培养软骨细胞.将第3代软骨细胞与多孔聚氨酯支架复合制备细胞-支架复合体.实验分为5组,分别为空载培养2周组(A组)、直接载荷培养2周组(B组)、空载培养4周组(C组)、直接载荷培养4周组(D组)、空载培养2周后载荷培养2周组(E组).空载培养时将细胞-支架复合体置于培养箱中孵育;载荷培养是在生物反应器中模拟体内关节微环境,对细胞-支架复合体进行垂直加压和界面旋转的复合载荷运动.各组于各时间点取材,行糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)/DNA定量分析,实时定量PCR检测Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)和表层蛋白(superficialzone protein,SZP) mRNA表达,并行甲苯胺蓝组织学观察和免疫组织化学染色观察. 结果 各组细胞-支架复合体分泌的DNA含量、GAG含量以及GAG/DNA比率比较差异均无统计学意义(P＞0.05).载荷培养后,大量GAG从支架释放至培养液中,且随载荷时间增加GAG释放相应增加(P＜0.05).Ⅰ型胶原mRNA相对表达量各组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05).经不同载荷培养后,B组Ⅱ型胶原mRNA相对表达量显著高于A组(P＜0.01),D、E组显著高于C组(P＜0.01);D、E组蛋白聚糖mRNA相对表达量显著高于C组(P＜0.01),E组显著高于D组(P＜0.01);B组COMP mRNA相对表达量显著高于A组(P＜0.01),E组显著高于C组(P＜0.01);E组SZP mRNA相对表达量显著高于C、D组(P＜0.05).甲苯胺蓝染色和免疫组织化学染色示,载荷培养能增强软骨细胞合成分泌GAG;各组Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色无变化,但D、E组表现较强的蛋白聚糖免疫染色增强作用. 结论 不同载荷均能促进以传代软骨细胞为基础的软骨再生,空载培养后载荷培养可能是佳的软骨再生培养模式,但载荷诱导第3代软骨细胞的软骨生成效应弱化.
