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胞浆泛素蛋白连接酶2在大鼠脊髓损伤后星形胶质细胞中的表达及意义
目的 研究胞浆泛素蛋白连接酶2 (Kipl ubiquitylation-promoting complex2,KPC2)在大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)过程中的蛋白表达及细胞定位情况,探讨其在SCI修复过程中的生物学功能.方法 将成年SD大鼠随机分为2组,对照组7只仅行单纯T9椎板全切除术,实验组49只采用改良Allen法制作T9节段脊髓撞击损伤模型,实验组于伤后6、12 h及1、3、5、7、14d分别取7只大鼠进行以下检测.采用Western blot检测p27kip1、KPC2、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和细胞周期蛋白A(CyclinA)在SCI前后的蛋白表达变化,免疫组织化学染色观察KPC2在SCI后的大体定位及表达,免疫荧光双标记染色观察KPC2在SCI过程中与神经元特异性核蛋白(neuronal nuclei,NeuN)、神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和PCNA的共定位情况.细胞水平采用体外培养星形胶质细胞增殖模型,Western blot检测KPC2、P27kip、PCNA表达;免疫共沉淀分析KPC2、KPC1和p27bp1之间在细胞增殖过程中的相互作用.结果 Western blot结果示SCI后3d,p27kip1显著下调,伴随KPC2、CyclinA、PCNA表达明显增加.免疫组织化学染色示KPC2阳性信号广泛分布,包括脊髓灰质和白质,实验组KPC2阳性细胞数显著高于对照组(t=10.982,P=0.000).免疫荧光双标记染色示在脊髓灰质,对照组和实验组KPC2与NeuN双标记阳性细胞数分别为(0.43±0.53)、(0.57±0.53)个/视野,比较差异无统计学意义(t=0.548,P=0.604);在脊髓白质,对照组和实验组KPC2与GFAP双标记阳性细胞数分别为(3.86±0.90)、(0.71±0.49)个/视野,差异有统计学意义(t=7.778,P=0.000);对照组和实验组KPC2与PCNA标记的星形胶质细胞共定位明显,阳性细胞数分别为(0.57±0.53)、(5.57±1.13)个/视野,差异有统计学意义(t=8.101,P=0.000).体外培养并模拟星形胶质细胞增殖,提取细胞蛋白行Western blot示PCNA和KPC2蛋白表达在血清刺激增殖后即开始增加,24h达峰值,而p27kip1表达则逐渐减少.免疫共沉淀示KPC2可沉淀p27kip1、KPC1,p27kip1也可沉淀KPC2、KPC1,且在刺激后相互作用明显增加.结论 SCI后KPC2参与介导的p27kip1表达下调,KPC2与SCI后星形胶质细胞的增殖相关.
