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中东呼吸综合征冠状病毒重组酶介导核酸检测方法的建立
目的 建立快速、敏感、特异的逆转录重组酶介导(Reverse-transcription recombinase-aid assay,RT-RAA)核酸检测方法,用于中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的检测.方法 根据MERS-CoV基因的保守序列设计并合成特异性RAA引物及探针.通过条件优化,以10倍系列稀释经第3代慢病毒载体构建的假病毒颗粒阳性标准品为模板,进行RT-RAA扩增,并进行特异性、敏感性以及临床样本检测.结果 建立的RT-RAA方法检测MERS-CoV假病毒颗粒阳性标准品的灵敏度为10拷贝/ml,高于实时荧光RT-PCR方法(102拷贝/ml);用该方法检测MERS-CoV假病毒颗粒有明显扩增,而甲型H1N1流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒等4种呼吸道病毒的检测均为阴性;检测我国首例输入性MERS病例的临床样本及1例英国QCMD协会的室间质评阳性灭活样本均能检出,与实际结果相符.检测时间(20 min)大大低于实时荧光RT-PCR (90 min).结论 建立的MERS-CoV RT-RAA检测方法灵敏、特异、快速,可用于MERS-CoV感染的现场快速检测和流行病学调查.
关键词： 中东呼吸综合征冠状病毒 重组酶介导 假病毒颗粒 -
中东呼吸综合征冠状病毒RT-RAA快速检测方法的建立及应用
建立基于重组酶介导的中东呼吸综合征冠状病毒(MERSCoV)核酸检测方法.本研究设计、合成特异性中东呼吸综合征冠状病毒基因的重组酶介导检测(RAA)引物及探针,制备MERS-CoV假病毒颗粒阳性对照品,通过一系列条件优化建立了MERS-CoV的快速、灵敏、特异的RT-RAA检测方法,分别与荧光定量RT-PCR检测方法做比较,并且采用首例中国MERS-CoV韩国地区输入病例的咽拭子样品、其它类似呼吸道病毒样本以及英国QC-MD的MERS-CoV室间质评灭活样本做临床验证.结果显示:建立的RT-RAA方法检测中东呼吸综合征冠状病毒灵敏度为10拷贝,高于本实验室建立的荧光RT-PCR方法灵敏度(100拷贝),且检测时间(4.8～13.6min)大大低于荧光RT-PCR检测时间(90min);用该方法检测中东呼吸综合征冠状假病毒颗粒为阳性,而检测其他8种对照呼吸道病毒均呈阴性;检测临床阳性样本也与实际结果相符.本研究建立的中东呼吸综合征冠状病毒RT-RAA检测方法灵敏、特异、快速,可用于中东呼吸综合征冠状病毒感染的现场快速诊断和流行病学调查.
