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携带CBP短发夹RNA基因腺病毒表达载体的构建
目的:构建编码4条大鼠CREB结合蛋白(rCBP)短发夹RNA(shRNA)的腺病毒,检测RNA干扰技术(RNAi)下调rCBP mRNA的能力.方法:根据RNAi原理,设计4条针对rCBP的shRNA序列.PCR技术和酶切连接技术构建重组穿梭质粒Pgenesil4-rCBP-EGFP;体外同源重组技术构建可同时编码4条rCBP shRNA的腺病毒(CBP-shRNA/Ad),并进行鉴定和滴度检测.荧光显微镜观察CBP-shRNA/Ad转染大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)效率,RT-PCR技术和实时定量PCR技术检测CBP-shRNA/Ad下调rCBP mRNA的能力.结果:经酶切鉴定和质粒测序证实CBP-shRNA/Ad构建成功.荧光显微镜下观察,感染复数为25的CBP-shRNA/Ad转染VSMCs效率达80%,并且细胞生长良好.相同剂量的CBP-shRNA/Ad转染VSMCs 24 h、48 h、72 h,rCBP mRNA含量持续下降(P＜0.05),并且72 h时rCBP mRNA含量低于空白对照组(P＜0.05).结论:CBP-shRNA/Ad可明显下调rCBP mRNA含量,对VSMCs无明显毒副作用,为基因治疗血管增殖性疾病奠定初步实验基础.
关键词： RNA干扰 腺病毒 环磷腺苷反应原件结合蛋白结合蛋白 血管平滑肌细胞 -
CBP基因沉默抑制血管平滑肌细胞增殖的研究
目的:探讨RNA干扰大鼠CREB结合蛋白(rCBP)基因对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响.方法:根据CBP cDNA序列构建可同时表达4条针对rCBP mRNA特异的短发夹RNA(shR-NA)、携带绿色荧光蛋白的腺病毒(CBP-shRNA/Ad).以空腺病毒为转染对照组、含非特异性shRNA编码序列的腺病毒为阴性对照组、感染复数为12、16、25、50的CBP-shRNA/Ad为干预组,转染0.1 U/mL凝血酶预处理的VSMCs 2 d.RT-PCR法、蛋白印记法分别检测rCBP mRNA和蛋白质的表达变化.流式细胞技术检测细胞周期,评价细胞增殖能力.倒置显微镜观察CBP-shRNA/Ad对细胞的毒副作用.结果:不同剂量的CBP-shRNA/Ad可在mRNA和蛋白质水平,明显抑制凝血酶诱导CBP高表达(P<0.05),具有量效依赖性.CBP-shRNA/Ad通过下调CBP含量,可使G0/G1期细胞比例显著升高(P<0.05),S期细胞比例下降(P<0.05),细胞周期被阻滞.倒置显微镜观察细胞贴壁状况良好.结论:RNA干扰技术可通过选择性下调rCBP的表达,显著抑制VSMCs的增殖,无明显细胞毒性.
关键词： 血管平滑肌细胞 RNA干扰 环磷腺苷反应原件结合蛋白结合蛋白 基因治疗
