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阴道毛滴虫沉寂信息调节因子Sir2同源基因克隆和蛋白表达
目的克隆并分析阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)沉寂信息调节因子Sir2基因,构建原核表达重组载体,表达重组蛋白,并制备抗体进行相关功能的研究.方法从阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离获得阴道毛滴虫Sir2同源基因的cDNA克隆、测序,并采用相关在线程序及软件进行序列分析.将cDNA部分片段亚克隆到原核表达载体pET-41a,转化宿主菌E.coli BL21,IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)诱导表达,亲和层析法纯化表达产物并对表达产物进行SDS-PAGE鉴定之后,用纯化重组蛋白免疫豚鼠获得抗血清,对重组蛋白和滴虫总蛋白进行蛋白质印迹鉴定.结果在阴道毛滴虫cDNA文库中获得一株1 034 bp的cDNA克隆,序列分析表明,该序列开放阅读框有912 bp,推测肽链具有304个氨基酸,等电点(PI)5.5.该肽链与酵母SIR2p蛋白及其同源物一致性高达30%～47%,并具有SIR2p及其同源蛋白的三个高度保守的特征性结构域.进化树结果显示,TvSIR2p接近线虫的SIR2蛋白,与同时克隆到的基因组TvSir2比较序列一致,证明该TvSir2基因组DNA不含内含子.PCR扩增出890bp片段,植入表达载体pET-41a;经酶切鉴定后取阳性克隆用IPTG诱导表达,产生融合蛋白产物经SDS-PAGE鉴定相对分子质量为62 000,与预期分子质量相符.用该融合蛋白免疫豚鼠得到的抗体,经Western blotting检测其与相应融合蛋白发生特异性反应,同时在33 000处也能识别滴虫虫体全蛋白.结论推测该克隆是阴道毛滴虫Sir2的同源基因,该基因没有内含子,它可能参与阴道毛滴虫的组蛋白去乙酰化作用及调节衰老和寿命.阴道毛滴虫Sir2基因可以在大肠杆菌中得到表达,并获得了相应的抗血清,为进一步研究其功能奠定了基础.
