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三种表达形式的SAG1基因对小鼠的免疫效果观察
目的构建了三种表达形式的弓形虫主要表面抗原(SAG1)基因-表膜型、分泌型和细胞内型,并分别用于免疫BALB/C小鼠.结果SAG1基因免疫小鼠后,表膜型和分泌型较细胞内型体液免疫出现早且反应强;细胞因子水平测试显示免疫后小鼠免疫反应趋向Th1型.攻击感染结果证实:表膜型和分泌型免疫小鼠较细胞内型免疫小鼠所获保护力强.结论三种表达形式的SAG1基因在小鼠模型中免疫效果不同.
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弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区在大肠杆菌中的表达
目的:克隆并表达弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段,为下一步表达蛋白纯化奠定基础.方法:将弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段克隆入高效融合表达载体pET32α,转化大肠杆菌BL21(DE3),37℃、IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物.结果:成功构建重组质粒pET32α-SAG1,经诱导后表达出含外源基因的融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物分子质量约44kDa.结论:弓形虫SAG1成熟蛋白编码区在原核表达系统pET32a/BBL21(DE3)中获得成功表达,为下一步表达蛋白纯化提供试验依据.
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弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆表达、纯化与鉴定
目的:构建弓形虫SAG1基因原核表达质粒,诱导表达重组蛋白SAG1,分离纯化并检测其免疫反应性.方法:设计一对特异引物,体外扩增SAG1目的基因(双酶切纯化后)定向克隆至质粒pET29a(+)中,转化到大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21,采用PCR、双酶切和测序等方法鉴定,并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的表达情况,经镍离子柱纯化重组蛋白后,用蛋白质印迹(Western blotting)分析与小鼠弓形虫阳性血清的免疫反应性. 结果:重组质粒经PCR、双酶切反应和测序鉴定,产物的大小与结构均与预期值相符,经IPTG诱导后,稳定表达相对分子量(Mr)为28 950的蛋白,纯化后的重组蛋白经Western blotting分析显示,与小鼠弓形虫感染血清有特异性反应条带.结论:成功构建重组表达质粒pET29a(+)-SAG1,使弓形虫表面抗原SAG1在体外获得表达,分离纯化的SAG1重组蛋白有免疫反应性.
