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根癌农杆菌介导的烟曲霉几丁质合成酶chsC基因缺失突变体的构建
目的 利用根癌农杆菌介导的基因转化定点插入突变几丁质合成酶chsC基因,实现基因失活而构建几丁质合成酶chsC基因缺失烟曲霉突变体.方法 构建根癌农杆菌二元载体pDHt/SK,利用根癌农杆菌介导的转化插入突变烟曲霉几丁质合成酶chsC基因,用潮霉素抗性基因筛选转化子,并进行实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定.结果 潮霉素抗性基因通过同源重组成功插入烟曲霉基因组中;经RT-PCR鉴定,烟曲霉几丁质合成酶基因chsC表达失活.结论 利用根癌农杆菌介导的基因转化可以定点插入突变并失活目的基因,此方法有可能成为烟曲霉基因转化和功能基因组研究的有力工具.
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重组人β-防御素-2基因的植物表达载体的建立
目的:许多证据表明:利用转基因植物作为生物反应器规模化生产高附加值的药用重组蛋白质,其技术可行、成本低廉、效益显著,具有广阔的应用开发前景.本研究拟运用植物转基因技术,尝试构建高效表达hBD-2的植物生物反应器的可能性.方法:将C端带Myc和6xHis双标记的hBD-2的重组DNA克隆到植物真核表达载体pCAMBLA1303中,构建C端带Myc和6xHis双标签的hBD-2的重组植物真核表达载体;并将此载体转化根癌农杆菌LBA4404,利用卡那霉素进行抗性基因筛选,确定根癌农杆菌的阳性克隆;通过根癌农杆菌将外源基因转入马铃薯植物愈伤组织细胞,利用潮霉素抗性基因筛选及PCR检测,监测hBD-2在其中的遗传表达.结果:(1)酶切分析、PCR验证和DNA测序等证据表明,C端6个组氨酸的hBD-2已被正确地插入pCAMBIA1304载体中CaMV 35S和Nos终止子之间,成功构建了重组hBD-2/His基因的植物表达载体rpCAMBIA1304/hBD-2/His.(2)rpCAMBIA1304/hBD-2/His已成功地转化根癌农杆菌LBA4404,阳性克隆菌株已获得.(3)潮霉素抗性进行筛选及PCR检测结果提示:hBD-2 cDNA基因已整合到马铃薯植物愈伤组织的基因组中.结论:结果表明,重组hBD-2/His基因的植物表达载体通过根癌农杆菌介导进入了马铃薯细胞植物愈伤组织.利用植物转基因技术,构建高效表达hBD-2的植物生物反应器具有可能性.
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根癌农杆菌介导的烟曲霉转化条件的优化
目的 探讨根癌农杆菌介导烟曲霉的遗传转化及其影响因素.方法 构建根癌农杆菌二元载体PDHt/SK,二元栽体转化根癌农杆菌,分别对共培养温度(23、24、25、26、27、28)℃、媒介(尼龙膜、硝化纤维膜、液相静置培养)、共培养时间(12、24、36、48 h)、预培养加乙酰丁香酮与否、加入乙酰丁香嗣的浓度(100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml);分生孢子与根癌农杆茵的不同比例(1:1、1 : 10、1:100、1:1000)进行根癌农杆菌介导烟曲霉的转化,观察上述条件下的根癌农杆菌介导的烟曲霉转化效率,用潮霉素抗性基因筛选转化子.结果 共培养温度、转化媒介、共培养时间、共培养加入乙酰丁香酮不同的浓度、分生孢子与根癌农杆茵的不同比例均对根癌农杆菌介导烟曲霉转化效率产生影响,但是预培养加乙酰丁香酮与否对根癌农杆菌转化烟曲霉的效率影响不明显.结论 根癌农杆菌可成功介导烟曲霉的遗传转化,其转化过程受诸多因素的影响.
