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嗜肺军团菌lvgA基因分析及实时荧光定量RT-PCR对军团菌的检测
目的 确定不同嗜肺军团菌lvgA基因序列的差异性及其感染宿主细胞后转录水平的变化,建立基于lvgA基因检测嗜肺军团菌的荧光定量RT-PCR.方法 通过使用NCBI/Blast,Pfam,TMHMM Server v. 2.0等网络资源分析嗜肺军团菌lvgA基因编码蛋白的保守功能结构域、跨膜区域.根据参考序列设计引物,采用PCR技术从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增lvgA基因,将其连接入克隆载体pMD18-T进行测序,并用cltust软件比较不同嗜肺军团菌菌株lvgA基因的核苷酸、氨基酸序列.根据lvgA基因和嗜肺军团菌16SrDNA序列内的特异保守区域设计引物,以实时荧光定量RT-PCR检测嗜肺军团菌在感染人单核巨噬样细胞THP-1后lvgA基因转录水平的变化,同时,采用基于lvgA基因的荧光定量RT-PCR对嗜肺军团菌患者血液样本进行检测.结果 研究表明,嗜肺军团菌lvgA基因为军团菌毒力基因,其产物定位于外膜表面.不同嗜肺军团菌菌株中lvgA基因的核苷酸序列和氨基酸序列保守,相似度分别达:99%,96%,96%和99%,98%,98%.在感染宿主细胞后lvgA基因的转录水平上调明显,高达4.3倍(P<0.05).基于lvgA基因的荧光定量RT-PCR方法可有效地检测嗜肺军团菌患者血液样本中的嗜肺军团菌.结论 lvgA基因与嗜肺军团菌的毒力相关,建立的基于lvgA基因的荧光定量RT-PCR方法具有快速、敏感、稳定等优点,适用于嗜肺军团菌肺炎临床实验室的早期诊断.
关键词： 嗜肺军团菌 lvgA基因 实时荧光定量RT-PCR -
PCR介导嗜肺军团菌疫苗候选基因lvgA和Hsp60的融合及其在大肠杆菌中表达的初步研究
目的采用PCR法进行嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的拼接融合,克隆并检测该融合基因在原核系统中表达情况,为进一步研究其免疫性能作必要的准备.方法采用重组聚合酶链反应,设计引物首先分别从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得待融合端互补的军团菌毒力基因(lvgA)和热休克蛋白60基因(Hsp60),经琼脂糖电泳纯化回收,再以适量lvgA和Hsp60为模板变性、退火、重叠延伸,实现二基因的PCR水平融合,随后采用外引物进行新一轮扩增,扩得足量lvgA/Hsp60融合基因的PCR产物,继而将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒,转化宿主菌BL21,经PCR、酶切及测序鉴定后,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析等鉴定.结果扩增出了约2292bp的lvgA/Hsp60融合基因,构建了原核表达重组质粒pGlvgA/Hsp60,并检测到Mr约117000的GST-lvgA-Hsp60融合蛋白表达条带.结论采用PCR法实现了嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的融合,构建了其原核表达重组质粒,并使该融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达,为进一步研究该融合基因的免疫学特性奠定了基础.
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嗜肺军团菌lvgA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
本实验采用聚合酶链反应(PCR)从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增得到军团菌毒力基因(Legionella virulence gene,lvg A gene),并将其定向连接入克隆载体pUC18,构建重组质粒pUlvgA,重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后,再将lvgA基因亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGlvgA,转化宿主菌JM109,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印记分析鉴定.实验结果表明,成功扩增出627 bp的lvgA基因,构建了重组质粒pUlvgA及原核表达重组质粒pGlvgA,并使53.7 KDa 的GST-lvgA融合蛋白质在原核系统中得到了有效的表达.
