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MicroRNA-136靶向CD163抑制CD68+CD163+M2型巨噬细胞极化的作用研究
目的:研究微小RNA(miR-136)通过靶向CD163抑制CD68+M0巨噬细胞向CD68+CD163+ M2巨噬细胞极化的作用机制.方法:采用流式细胞术检测20例肝细胞肝癌患者肿瘤组织及癌旁组织中CD68+ CD163+ M2巨噬细胞的比例,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测肿瘤及癌旁组织中miR-136的水平.分离人脾脏中CD68+ M0巨噬细胞,将细胞分为对照组(Control),miRNA模拟物组(miRNA mimic)和miRNA抑制物组(miRNA inhibitor).IL-4和IL-13 10ng/mL诱导巨噬细胞M2型极化.采用流式细胞术检测CD68+ CD163+ M2巨噬细胞比例,Western blot检测细胞中CD163、TNF-α、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达以及M2巨噬细胞标志物精氨酸酶(Arg1)的表达,机制研究中检测JAK/STAT信号中蛋白酪氨酸激酶1(JAK1)、信号转导子与转录激活子1(STAT1)和STAT6的水平,PI3K/AKT信号中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)的表达.荧光素酶报告基因法确定miR-136与CD163的靶向关系.结果:肝癌组织中M2型巨噬细胞比例显著高于癌旁组织,而miR-136的表达显著低于癌旁组织,两者表达具有负相关.荧光素酶报告基因结果显示CD163是miR-136的靶基因.miRNA mimic组中CD68+ CD163+ M2巨噬细胞比例显著低于miRNA inhibitor组,与Control组比较无统计学差异.机制检测中发现miRNA mimic中JAK1、STAT6、PI3K、AKT1低表达,说明miR-136可以间接抑制JAK1-STAT6以及PI3 K-AKT1的表达,抑制M2巨噬细胞极化.结论:miR-136可以靶向CD163抑制M2型巨噬细胞极化,其作用机制与JAK1-STAT6以及PI3 K-AKT1抑制有关,这是M2巨噬细胞在肝癌免疫中的调节机制之一.
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微小RNA-136对肺腺癌A549细胞增殖的影响
目的 观察微小RNA(miRNA,miR)-136对肺腺癌A549细胞增殖的影响.方法 采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肺腺癌细胞株A549和正常支气管上皮细胞株16HBE中miR-136的表达,采用脂质体转染的方法将40nmol/L的miRNA抑制剂转染至肺腺癌细胞株A549中,抑制miR-136的表达,并采用RT-PCR的方法验证抑制效果.采用噻唑蓝(MTT)法和软琼脂克隆形成实验检测下调miR-136对A549细胞的增殖能力的影响.采用Western blot的方法检测转染20、40nmol/L的miRNA抑制剂下调A549细胞中的miR-136表达对细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路的影响.结果 RT-PCR的检测结果显示,A549细胞中相对表达量为1.39±0.33,明显高于正常支气管上皮细胞株16HBE(0.35-±0.12),差异有统计学意义(t=13.165,P=0.002).脂质体转染后的抑制剂组和对照组miR-136相对表达量分别为0.21 ±0.08、1.32±0.29,与对照组比较,转染miR-136抑制剂的A549细胞中miR-136的表达显著降低,差异有统计学意义(t=15.016,P=0.000).MTT实验结果显示:抑制A549细胞中miR-136的表达之后,细胞的增殖能力显著下降,与对照组比较,转染抗miR-136之后第5天细胞的吸光度值下降至1.25 ±0.04(t=7.258,P=0.013).软琼脂克隆形成实验结果显示:每视野下miR-136抑制剂组和对照组细胞的克隆数分别为7.55±2.48、21.2 ±6.15,差异有统计学意义(t=9.127,P=0.008);Western blot检测结果显示,抑制A549细胞中miR-136的表达使ERK1/2以剂量依赖的方式降低活性.转染20、40nmol/L的抗miR-136 72 h后,与对照组比较,分别有50％、90％的ERK1/2磷酸化受到抑制,差异有统计学意义(,=8.339,P=0.009;x2 =11.023,P=0.000).结论 miR-136下调能抑制A549细胞的增殖,可能是通过抑制ERK1/2通路激活实现的.
关键词： 肺肿瘤 微小RNA-136 细胞外信号调节激酶1/2 细胞增殖 -
微小RNA-136在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义
目的 检测微小RNA(miRNA,miR)-136在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达,探讨NSCLC的临床病理学特征与其表达之间的关系.方法 应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、原位杂交的方法检测37对NSCLC肿瘤组织及其相应的癌旁组织中miR-136的表达,并分析其与临床病理特征之间的关系.结果RT-PCR检测结果显示miR-136的相对表达量在NSCLC组织、癌旁组织分别为3.78±1.77、1.15±0.38,差异有统计学意义(P＜0.01);原位杂交检测结果显示,miR-136阳性表达率在NSCLC组织、癌旁组织中分别为(80.8±20.3)％、(23.6±15.2)％,差异有统计学意义(P＜0.05);与相应的癌旁组织比较,在NSCLC肿瘤组织中,miR-136的表达显著增加.miR-136的高表达与患者的临床病理学特征如年龄、性别、TNM分期及有无淋巴结转移无明显相关(P＞0.05),但是和肿瘤的病理类型、分化程度显著相关(P＜0.05).结论miR-136在NSCLC中呈高表达,有助于判断NSCLC的进展及侵袭性.
